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油茶主要病害检测和生物控制技术研究

宋光桃  
【摘要】:油茶炭疽病(Camellia oleifera anthracnose)和根腐病(root rot disease)是我国油茶产区的主要病害。油茶炭疽病常引起落果、落蕾,落果率一般在20%-40%,严重时达80%以上;油茶根腐病使受害油茶根部腐烂,导致植株不能正常生长而死亡,它们给油茶生产带来巨大经济损失。当前主要通过化学防治来控制这些病害,但易引发病原菌产生抗药性和环境污染,直接或间接危害人体健康。本研究对这两种病原菌的分子快速检测、高效拮抗菌株分离筛选及鉴定、拮抗菌株对病原菌的抑菌机理、发酵工艺优化、菌剂配制与田间防治等技术进行了系统地研究,以期为油茶主要病害可持续控制提供理论依据和奠定应用基础。 (1)从病原菌的形态特征、致病性测定、rDNA ITS序列测定、系统发育树构建等方面鉴定油茶炭疽病菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),油茶根腐病菌为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)。根据油茶炭疽病菌ITS的序列差异设计了特异性引物YT1和YT2,对胶孢炭疽菌进行检测,可扩增出约330bp的特异性条带,对炭疽菌属胶孢炭疽菌以外的16种炭疽菌进行检测,均未扩增出特异性条带。用引物YT1和YT2进行常规PCR方法扩增,可检测含量为1pg/25μL的胶孢炭疽菌,进行巢式PCR方法扩增,可检测含量为10ag/25μL的胶孢炭疽菌,检测灵敏度提高了100000倍;根据油茶根腐病菌ITS的序列差异设计了特异性引物GF1和GF2,对层生镰刀菌进行检测,可扩增出约400bp的特异性条带,对镰刀菌属层生镰刀菌以外的16种镰刀菌进行检测,均未扩增出特异性条带。用引物GFl和GF2进行常规PCR方法扩增,可检测含量为1pg/25μL的病原菌,进行巢式PCR方法扩增,可检测含量为100ag/25μL,检测灵敏度提高了10000倍。以YT1、YT2和GF1、GF2分别为油茶炭疽病菌和油茶根腐病菌的特异性引物,用巢式PCR方法并结合油茶组织总DNA的提取方法,可在病害发生潜育期,发病初期进行病原菌DNA的PCR扩增,快速、灵敏地检测油茶炭疽病菌和油茶根腐病菌。 (2)采用稀释分离法从健康油茶组织中分离得到75株内生细菌,从不同来源的38份土壤中分离得到223株土壤细菌和194株土壤放线菌,以油茶炭疽病菌和根腐病菌为靶标,通过平板对峙试验以447株分离菌株进行初筛.共筛选出抑菌圈大于5mm的内生细菌6株,土壤细菌21株,抑菌圈大于10mm的放线菌14株,以8种植物病原菌为靶标复筛,筛选出对油茶主要病害有良好拮抗作用的3株拮抗细菌(菌株R6、菌株Z17、菌株Z26)和2株拮抗放线菌(菌株F10、菌株CF17)。通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,鉴定菌株R6为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株Z17为科本类芽孢杆菌(Paenibcillus kribbens),菌株Z26为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),菌株F10为球孢链霉菌球孢亚种(Streptomvces globisporus subsp.globisporus),菌株CF17为小白链霉菌(Streptomyces albulus)。 (3)菌株F10和菌株CF17能影响油茶炭疽菌和根腐病菌菌丝正常生长和分生孢子萌发,菌丝出现节间变短、变粗、扭曲变形、菌丝严重交联、细胞质聚集、外溢等现象,能产生抗菌活性物质,在常温下稳定,多次传代后对油茶炭疽病菌和根腐病菌仍有较强拮抗效应,与拮抗细菌菌株Z26无抑菌性,但不耐高温和抗紫外线,对强酸、强碱不够稳定:菌株F10能分泌蛋白酶和纤维素酶,能耐可杀得、代森锰锌等杀菌剂,对水稻、蚕豆、白菜种子萌发有促生作用。菌株CF17能分泌蛋白酶,能耐可杀得、敌克松等杀菌剂,对水稻种子萌发有促生作用。 (4)综合考虑菌株CF17的菌体生长量(菌体干量)和对油茶炭疽病菌的抑菌率两个指标,研究不同发酵培养基、不同碳源、氮源等营养因子,以及接种量、装液量、初始pH值等非营养因子对菌株CF17发酵液生物活性的影响。结果表明:菌株CF17的优化培养液为:葡萄糖15g、酵母膏10g、NaCl1g、KH2P041g、CaCO33g、蒸馏水1000mL.pH7.0,在300mL三角瓶中装入发酵培养液100mL,接入种子发酵液的接种量为100%,在30℃、140r/min的条件下振荡培养7d。 (5)以过80目细筛的米糠按1:2的料液比与菌株CF17的发酵液混合配成原粉,经抑菌活性测定,润湿性、分散性、悬浮性综合评价测定,菌剂最优配方为原粉40%,高岭土38%,木质素磺酸钠10%,十二烷基硫酸钠7%,腐植酸5%。此菌剂在盆栽防治中表明对油茶炭疽病防治效果很明显,500倍的菌剂稀释液的防治效果可达80%以上,优于对照药剂多菌灵的防治效果,对油茶根腐病也有较好的防治效果,而且可以促进油茶幼苗的生长。


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