油桐种子转录组解析及油脂合成重要基因克隆

【摘要】：油桐原产中国,与油茶、核桃、乌桕并称我国四大木本油料植物,其种子可用来制取桐油,曾经是一种世界最著名的制造高档油漆和油墨的优质原料,也是制造生物柴油的重要原料,还是制造新型复合功能材料的重要原料,具有很高的经济利用价值。研究油桐种子中油脂合成的机理不仅能为木本植物油脂积累的研究奠定重要的理论基础,还可能利用克隆的重要基因对油桐进行分子遗传改良,从而大幅度提高桐油的单位面积产量,提高桐油品质及其对不良环境的抗逆能力。以往的研究大都集中于传统的栽培和育种方面,相关的分子生物学研究还不够深入,没有涉及到基因的功能研究,这远远不能适应油桐遗传学、分子生物学和育种学的种种需求。造成这一局限性的原因是缺少有用的参考基因序列信息。本研究利用Illumina测序技术分别在6月、8月、10月对油桐处于不同发育时期种子的转录组进行测序,对3个不同时期种子的转录组进行比较分析、基因表达差异分析、和油脂合成代谢等代谢途径解析；在此基础上,对FATA基因和KASⅢ基因进行了基因克隆和功能研究,主要研究结果如下：1、油桐种子转录组数据的序列组装、基因功能注释和分类。对Ⅰ期转录组数据中52,039,198个clean reads进行组装后获得98,909个contigs和61,001个Unigene,其中长度在75-200nt范围内的Contig片段有54,918条。对Ⅱ期转录组数据中51,886,702个clean reads进行组装后获得87,848个contigs和54,679个Unigene,其中长度在75-200nt范围内的Contig片段有47,735条。对Ⅲ期转录组数据中52,734,436个clean reads进行组装后获得69,253个contigs和44,495个Unigene,其中长度在75-200nt范围内的Contig片段有34,274条。对相关cDNA序列进行基因注释,共有41,059条Unigene序列能够与公共数据库中的已知基因匹配,占所有非冗余基因的70.3%。3个不同时期的油桐种子转录组共有26,625条Unigene与COG数据库中的基因具有同源性,这些Unigene根据预测的功能可分为25类。GO分类将油桐3个转录组的30,280个非冗余Unigene(占Unigene总数的51.8%)归类于61个组。KEGG的PATHWAY数据库对油桐种子油脂合成不同时期的3个转录组数据进行了详细的解析,将非冗余基因归于128个代谢途径。2、油桐种子油脂合成代谢途径基因表达模式解析。将油桐种子3个不同发育时期的转录组进行两两比较后,对差异表达Unigene进行GO分析并分别归类于57(ⅡvsⅠ)、59(Ⅲ vsⅡ)和61(Ⅲ vs Ⅰ)个组,同时将获得的差异表达Unigene分别归于126 (ⅡvsⅠ)、127(ⅢvsⅡ)和127 (ⅢvsⅠ)个代谢途径。对3个时期的转录组数据进行Pathway富集性分析发现共有54个Unigene可归类于脂肪酸生物合成途径,占所有非冗余Unigene的0.24%。将54个Unigene序列在KEGG数据库中比对后获得14个与其它物种同源的脂肪酸合成相关基因并对这些基因在油桐油脂合成期的表达模式进行了分析。对3个时期的转录组数据进行Pathway富集性分析发现共有428个Unigene可归类于甘油磷脂代谢途径,占所有非冗余Unigene的1.93%。将428个Unigene序列在KEGG数据库中比对后获得31个与其他物种同源的甘油磷脂代谢相关基因并对这些基因在油桐油脂合成期的表达模式进行了分析。3、油桐FATA基因的克隆与功能研究。通过RACE技术克隆了长度为1480 bp的油桐FATA基因的全长cDNA序列,并在此基础上利用PCR技术克隆了FATA基因的CDS序列和基因组序列,长度分别为1113 bp和3801 bp。通过序列比对发现,油桐FATA蛋白质序列与其它植物的FATA序列之间具有较高的同源性,这证实了我们克隆出的基因确实是油桐的FATA基因。系统演化分析发现,油桐FATA与麻风树FATA的亲缘关系最近,其次是蓖麻(Ricinus communis)FATA,而与蒺藜状苜蓿FATA的亲缘关系最远。通过Southern杂交分析发现,FATA基因在油桐基因组中以单拷贝形式存在。油桐FATA基因在根、叶和种子中都有表达,其中在叶、子叶和幼根中的表达量无明显差异,而在种子中,表达量随着种子的发育逐渐升高,且在I期即油脂刚开始合成时的表达量高于叶、子叶和幼根中的表达量。利用TAIL-PCR技术克隆了油桐FATA基因的启动子,为后续基因的表达调控研究奠定了基础。4、油桐KAS III基因的克隆与功能研究。同样,通过RACE技术克隆了长度为1651 bp的油桐KAS III基因的全长cDNA序列。通过序列比对发现,油桐KAS III蛋白质序列与其它植物的KAS III序列之间具有较高的同源性。系统演化分析发现,油桐KAS III与麻风树和蓖麻KAS III的亲缘关系较近。表达模式研究表明,油桐KAS III基因在根、叶和种子中都有表达,其中在叶、子叶和幼根中的表达量无明显差异,而在种子中,表达量随着种子的发育逐渐升高,且在I期即油脂刚开始合成时的表达量高于叶、子叶和幼根中的表达量。总之,本研究为油桐油脂合成机理的解析提供了有价值的科学依据,也为油桐的分子遗传改良奠定了一定的物质和技术基础。