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Klebsiella pneumoniae 2e甘油脱水酶活因子的表达及其催化性质研究

蒋欢  
【摘要】:随着生物柴油产业的规模化发展,其低值副产物粗甘油的产量也迅速增加。大量粗甘油的产生与积累已经成为影响生物柴油产业能否可持续发展的重要因素之一。通过微生物发酵将粗甘油直接转化成高值化学品1,3-丙二醇(1,3-propanedio,简称1,3-PDO)是目前极具前景的粗甘油利用途径。甘油脱水酶是微生物合成1,3-PDO中的关键限速酶,该酶对于1,3-PDO的合成速率以及产率起到关键作用,因此研究甘油脱水酶对发酵产1,3-PDO具有重要作用。本研究以一株筛选出的粗甘油耐受型菌株Klebsiellapneumoniae 2e为研究对象,通过对Klebsiella pneumoniae 2e基因组分析,发现Klebsiella pneumoniae 2e基因组中含有两个甘油脱水酶激活因子编码有关的基因,并进行进一步的生物信息学分析得到这两个基因组编码的很可能为新的甘油脱水酶激活因子。本文首先对这两个基因分别进行了生物信息学分析,并克隆表达了这两个甘油脱水酶激活子基因,对其进行酶学性质分析,获得的主要结果如下:1.利用分子生物信息学对甘油脱水酶激活因子基因orfW和orfY分别进行分析,orfW基因与甘油脱水酶激活因子基因dhaB4的序列相似性高达65.47%,而orfY蛋白的结构域和甘油脱水酶激活因子dhaG相同,并通过同源建模获得了这两个基因的三维结构信息以及进化树的构建,发现orfW基因在进化树地位上与Lactobacillus diolivorans二醇脱水酶的再激活酶相近,orfY基因在进化树地位上与Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶的再激活酶地位相近,结果表明这两个基因具有甘油脱水酶再激活酶功能。2.以Klebsiellapneumoniae 2e基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到甘油脱水酶激活因子基因orfW和orfY,分别连接到表达载体pcold-TF上,得到重组质粒pcold-orfW 和 pcold-orfY,测序正确后,将质粒分别转化至 Escherchia.coli Rosseta(DE3)中进行诱导表达,得到可溶性蛋白并将其纯化,纯化后的蛋白经SDS-PAGE结果显示,在70kDa和67kDa处有特异性蛋白,结果与预期相符。在辅酶B12、ATP和Mg2+的存在下,以Klebsiella pneumoniae2e的甘油脱水酶为对象进行激活实验,结果证明,重组质粒pcold-orfW和pcold-orfW的表达产物具有甘油脱水酶激活因子活性。3.在酶活性分析中,失活的甘油脱水酶分别被甘油脱水酶激活因子基因orfW和orfY进行激活,激活程度随时间的增长而逐渐变大,orfW的最适温度和最适pH分别为37℃和8.0,orfY的最适温度和最适pH分别为30℃和9.0,orfW对失活的甘油脱水酶的激活作用大于orfY。将orfW和orfY共同激活失活的甘油脱水酶时,共同作用的结果低于orfW单独激活甘油脱水酶所生成的丙醛含量,但是酶活力大于orfY基因。结果表明,orfW和orfY都是甘油脱水酶激活因子,能对失活的甘油脱水酶进行激活。4.对Klebsiella pneumoniae 2e中甘油脱水酶激活因子基因orfW、orfY、dhaF和dhaG在不同浓度粗甘油杂质中的转录水平进行了检测分析,结果表明Klebsiella pneumoniae 2e中甘油脱水酶基本不受粗甘油杂质影响是因为四个甘油脱水酶激活因子的共同作用。


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