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杉木ClKptA/Tpt1基因的功能研究

杨世全  
【摘要】:KptA/Tpt1是广泛存在于生物中的一种磷酸转移酶,其功能是在tRNA的剪接过程中将磷酸基团转移到NAD+上,进而形成ADP-核糖基化。磷不但是核酸合成、植物生长、发育所必须的大量元素,而且是重要的信号分子。除此之外,磷可影响植物木质素的生物合成,通过改变磷的含量可以改变植物木质素的含量和木材密度。杉木(Cunninghamia lanceolate(Lamb.)Hook)是我国南方主要的用材树种,因其材性优良而深受人们喜爱。然而,杉木ClKptA/Tpt1基因目前尚未被克隆,磷是否可调控该基因的表达进而影响木质素的生物合成仍不清楚。因此,本论文基于磷处理后的杉木转录组数据,克隆了ClKptA/7pt1基因,主要研究了以下内容:(1)基于杉木转录组数据,克隆了杉木磷酸转移酶ClKptA/Tpt1基因。结果表明ClKptA/Tpt1基因CDS长1143 bp,编码381个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现,该蛋白有很强的保守性,存在特征性HGT motif。功能结构域分析发现,KptA/TpJ1基因从原核生物到真核生物普遍存在PTS-2-RNA superfamily亚家族功能结构域。跨膜结构分析发现该蛋白不具有跨膜结构域。聚类分析发现,杉木中该基因与橡胶树中该基因的亲缘关系最近,与相思豆的中该基因的亲缘关系最远,说明该基因在草本植物和木本植物进化过程中出现了分化。ClKptA/Tpt1蛋白质三级结构预测发现,主要以α-螺旋和β-折叠的形式存在。(2)提取了杉木不同部位的RNA,逆转录成cDNA。通过qRT-PCR分析发现,ClKptA/Tpt1基因在杉木叶中的表达量最高,在茎中表达量最低。用0.0 mmol/L、0.067 mmol/L、0.133 mmol/L、0.20 mmol/L 不同浓度的 NaH2PO4 处理杉木。qRT-PCR分析表明,ClKptA/Tpt1基因在杉木叶中的表达量随着磷浓度的增加而增加,木质素含量也随着磷浓度的增加而增加。冷冻切片发现,磷处理下,杉木木质部着色随着磷浓度增加也逐渐加深,其木质部细胞更加紧密,木质部细胞层增加,细胞体积减小。结果表明,磷调控了ClKptA/Tpt1基因的表达,进而影响了木质素的生物合成。除此之外,利用染色体步移技术克隆了ClKptA/Tpt1基因启动子序列,获得了518 bp,分析发现,含有8个TATA-box、12个CAAT-box两个重要的顺式作用原件,因此说明该启动子序列满足基本的启动子核心原件。除了上述重要的顺式作用元件外,还有应答氧胁迫的原件ARE,增强子原件CAAT-box。获得PClkptA/Tpt1::GUS抗性组培苗以及构建了ClKptA/Tpt1的亚细胞定位载体 pE3308-GFP-ClKptA/Tpt1。(3)构建了pCold-TF-ClKptA/Tpt1原核表达载体,加入终浓度分别为0.0、0.4、0.6、0.8 mmol/LITPG诱导。SDS-PAGE电泳检测发现,在大约100 kD处有大量的蛋白富集,在0.6 mmol/L浓度下的IPTG有最好的诱导效果。纯化了该蛋白,分析了 0.0μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.8 μmol/L 不同磷浓度下该酶活性。结果表明,纯化的ClKptA/Tpt1具有酶活性,在0.1μmol/L浓度时的活性最高,随后,随着磷浓度的增加酶活降低。除此之外,在杨树中过表达了ClKptA/Tpt1基因,获得了三株表达量高的转基因植株,命名为ClKptA/Tpt1-1、ClKptA/Tpt1-2、ClKptA/Tpt1-3。木质素含量测定发现,转基因杨树的木质素含量是野生型木质素含量的1.52倍、1.68倍、1.75倍,利用冷冻切片发现,转基因杨树的木质部染色较深、面积大,木质部细胞紧密。用24 mg/L的高磷处理后,发现转基因杨树ClKptA/Tpt1-1、ClKptA/Tpt1-2、ClKptA/Tpt1-3木质素含量分别是野生型的1.18倍、1.27倍、1.34倍。综上可以得出,过表达ClKptA/Tpt1基因可以明显增加木质素的含量,但高磷处理时抑制了该基因的表达,进而影响了木质素的积累。


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1 杨世全;杉木ClKptA/Tpt1基因的功能研究[D];中南林业科技大学;2020年
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