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硫化氢对甲醛损伤PC12细胞的保护作用及其机制

任衍开  
【摘要】:【研究背景与目的】 甲醛(formaldehyde, FA)是一种具有挥发性的有毒物质,其神经毒性越来越受到人们的关注。甲醛暴露可直接造成中枢神经系统的损害。同时,人类机体自身也可产生甲醛,内源性甲醛慢性损伤可能是神经退行性疾病发病的一个重要机制。因此,深入探讨甲醛神经毒性的防治措施具有重要意义。 硫化氢(hydrogen sulfide, H_2S)广泛参与机体多种生理和病理过程,被认为是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三类气体信号分子。近年来,内源性H_2S对神经功能的调节作用已得到公认,特别是其抗氧化、神经保护的功能倍受关注。 越来越多的证据显示氧化应激是甲醛暴露时产生的最关键效应。是否可以用H_2S来防治甲醛的神经毒性呢?值得深入研究。为此,本研究将以甲醛损害PC12细胞为甲醛神经毒性的细胞模型,探讨H_2S对甲醛神经毒性的拮抗作用及其机制。 【方法】 胎盘蓝拒染法观察PC12细胞的存活率;Elisa法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的含量,评价PC12细胞的损伤程度;Hoechst 33258染色后,荧光显微镜下观察PC12细胞核染色体形态改变及PI染色流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡;罗丹明123 (Rhodamine123, Rh123)染色后,FCM检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP);JC-1染色后,荧光显微镜下观察细胞内MMP变化; DCFH-DA染色后,荧光显微镜及FCM检测细胞内活性氧(reactive oxydren species, ROS)水平;Western Blot检测PC12细胞内Bcl-2和对氧磷酶-1 (Paraoxonase-1, PON-1)的蛋白表达状况以及细胞色素c (cytochrome c, Cyt-c)的释放;分光光度计法检测PC12细胞内PON-1活性。 【结果】 1.甲醛对PC12细胞的毒性作用及机制 甲醛(60、120、240μmol/L)处理PC12细胞24 h后,能浓度依赖性地抑制PC12细胞的活力、促进细胞LDH的释放。PC12细胞经120μmol/L甲醛处理24 h后,细胞变成圆形或椭圆形,而且可见部分细胞游离于孔壁呈悬浮状态,并有大量的胞核呈现为强荧光的凋亡细胞;PI染色FCM定量分析亦表明甲醛(120μmol/L)作用24 h可显著诱导PC12细胞凋亡。上述结果表明甲醛对PC12细胞具有毒性作用。 120μmol/L甲醛作用9 h后,细胞MMP下降;PC12细胞经60、120、240μmol/L甲醛作用24 h后,Bcl-2蛋白表达水平呈浓度依赖性地降低,Cyt-c的释放呈浓度依赖性地增强,表明甲醛可通过激活细胞线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡和神经毒性。 120μmol/L甲醛处理PC12细胞9 h后,细胞内ROS显著升高;甲醛(60、120、240μmol/L)作用24 h后,PC12细胞PON-1的蛋白表达及其酶活性呈浓度依赖性地降低,提示甲醛的神经毒性与其抑制PON-1蛋白表达及其酶活性,进而促进ROS积累有关。 2.硫化氢对甲醛损伤PC12细胞的保护作用及机制 200μmol/L H_2S预处理30 min可明显升高120、240μmol/L甲醛作用24 h后的PC12细胞活力,200、400μmol/L H_2S预处理30 min可明显升高120μmol/L甲醛作用24 h后的PC12细胞活力。200μmol/L H_2S预处理PC12细胞30 min能显著降低120μmol/L甲醛处理24 h后对细胞LDH释放的促进作用、对细胞形态的损害作用、对细胞凋亡的诱导作用。这些结果表明H_2S对甲醛损伤PC12细胞具有拮抗作用。 200μmol/L H_2S预处理30 min可显著抑制120μmol/L甲醛对PC12细胞MMP的降低作用、对Bcl-2表达的下调作用和对Cyt-c释放的促进作用,表明H_2S可阻止甲醛激活细胞线粒体凋亡通路。 200μmol/L H_2S预处理30 min可显著减轻120μmol/L甲醛对PC12细胞内ROS积累的诱导作用、对细胞PON-1表达及其活性的抑制作用,而且200μmol/L H_2S可显著增强PON-1的活性,表明H_2S可抑制ROS积累,阻止甲醛抑制PON-1的表达和活性,并能上调PON-1的活性。 200μmol/L PON-1的特异性抑制剂二羟基喹啉(2-Hydroxy-4-methylquinoline, 2-HQ)预处理30 min可显著降低200μmol/L H_2S对甲醛(120μmol/L, 24h)促进PC12细胞内ROS积累、诱导细胞凋亡、降低PC12细胞活力的拮抗作用,表明H_2S可通过阻止甲醛抑制PON-1的表达和活性、增强PON-1的活性而降低细胞ROS的积累,进而阻止甲醛激活细胞线粒体凋亡通路而实现其抗甲醛神经毒性作用。 【结论】 1.甲醛对PC12细胞具有细胞毒性作用,其机理可能与其抑制细胞PON-1蛋白的表达和活性,从而促进细胞内ROS的积累,进而激活细胞线粒体凋亡通路有关。 2.硫化氢可拮抗甲醛对PC12细胞的毒性作用,其机理可能与其增强细胞PON-1活性、减轻甲醛对PON-1蛋白表达和活性的抑制作用,从而降低细胞内ROS含量,并进一步抑制甲醛激活细胞线粒体凋亡通路有关。


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