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抗EGFRvⅢ特异性单链抗体的构建及其靶向性研究

张庆丽  
【摘要】:目的:应用噬菌体展示技术筛选出能与EGFRvⅢ特异性结合的单链抗体(single-chain Fv,scFv),并研究其生物学活性。 方法:利用抗原PEP3-KLH免疫BALB/c小鼠,扩增VH、VL片段后拼接成scFv片段,克隆入pCANTAB5E-Thrombin载体,电转化Hpd3细胞,构建EGFRvⅢ特异性scFv噬菌体库。用PEP3-BSA进行ELISA筛选,阳性克隆测序分析,并将阳性EGFRvⅢ-scFv质粒重新克隆入pCANTAB-Thrombin-His载体,转化E.coli ER2738,IPTG诱导EGFRvⅢ-scFv表达,上清沉淀后经Ni Sepharose 4 Fast Flow纯化得到可溶性scFv。间接免疫荧光及活体成像技术鉴定EGFRvⅢ-scFv与EGFRvⅢ的特异性结合。 结果:成功构建了库容为2.23×10~8的EGFRvⅢ-scFv噬菌体单链抗体库,ELISA筛选得到16个EGFRvⅢ-scFv克隆,取一克隆命名为EGFRvⅢ-scFv-2A1。EGFRvⅢ-scFv-2A1质粒重新克隆入pCANTAB-Thrombin-His载体,成功表达可溶性EGFRvⅢ-scFv-2A1。EGFRvⅢ-scFv-2A1在体外可特异性结合HuH7-EGFRvⅢ细胞,但不结合HuH7-EGFR细胞;荧光标记的EGFRvⅢ-scFv-2A1体内可富集到U87MG-EGFRvⅢ细胞移植瘤,在U87MG细胞移植瘤处没有富集。 结论:成功筛选抗EGFRvⅢ-scFv-2A1,该抗体在肿瘤的影像诊断和靶向治疗中可能具有一定作用。


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