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S100A13基因在甲状腺癌中的表达及相关作用研究

曹仁贤  
【摘要】:甲状腺癌(thyroid carcinoma)是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一,发病机制尚未明确。S100蛋白家族是一个已发现有21个成员的钙结合蛋白家族,S100蛋白通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用在体内发挥多种生物学功能。S100A13属于钙结合蛋白家族的一个新成员,S100A13既具有S100蛋白家族的一些共性,又有其独有的结构和功能特点。FGF-1是成纤维细胞生长因子家族重要的成员之一,一些高侵袭性的肿瘤与FGF-1的高表达有关。研究表明S100A13通过介导FGF-1、IL-1α跨膜转运,在肿瘤、炎症、动脉硬化等疾病的病理过程中发挥着重要作用。 本研究在前期运用抑制性消减杂交技术( suppression subtractive hybridization, SSH)筛选正常甲状腺组织和甲状腺癌组织内差异表达的基础上,通过免疫组织化学的方法检测正常甲状腺组织和甲状腺癌组织内S100A13蛋白、FGF-1蛋白的表达,发现并验证了S100A13基因在甲状腺癌中的表达高于正常甲状腺组织。在此基础上,通过构建S100A13基因真核表达载体、基因转染等方法观察S100A13基因在甲状腺癌组织高表达后S100A13基因对人甲状腺髓样癌细胞(TT细胞)生长特性、裸鼠移植瘤生长的影响,结果发现高表达S100A13基因对TT细胞的生长具有促进作用,能促进TT细胞从G0/G1期向S期及G2/M期过渡,S100A13高表达的TT细胞裸鼠移植瘤生长速度最快,重量最重,移植瘤中S100A13的高表达能增强Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白的表达。随后观察shRNA干扰S100A13基因表达和使用Ca~(2+)螯合剂后对TT细胞释放FGF-1的影响,结果发现S100A13基因的沉默可以抑制FGF-1从细胞内释放到细胞外,Ca~(2+)螯合剂能有效拮抗无血清处理引起的TT细胞[Ca~(2+)]i升高和S100A13、FGF-1蛋白的释放。实验结果表明S100A13基因高表达后促进FGF-1表达和释放是甲状腺癌发生和转移的重要机制。 第一部分甲状腺癌组织中S100A13和FGF-1蛋白的表达及意义 目的:探讨S100A13、FGF-1蛋白在甲状腺癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组织化学法,检测56例甲状腺癌、15例甲状腺腺瘤、14例甲状腺正常组织中S100A13及FGF-1蛋白的表达。结果:甲状腺癌、甲状腺腺瘤、甲状腺正常组织中S100A13蛋白阳性表达率分别为91.1%、66.7%、64.3%,FGF-1蛋白阳性表达率分别为89.3%、60.0%、57.1%,其中甲状腺癌与甲状腺腺瘤、甲状腺正常组织比较均有显著性差异(P0.05);伴有淋巴结转移的甲状腺癌组织S100A13、FGF-1蛋白强阳性表达明显高于无淋巴结转移者(P0.05)。结论: S100A13蛋白、FGF-1蛋白在甲状腺癌中阳性表达显著高于甲状腺腺瘤及正常甲状腺组织,其强阳性表达与淋巴结转移有关。 第二部分S100A13对甲状腺癌TT细胞生长特性的影响 目的:观察S100A13基因高表达对TT细胞生长特性的影响。方法:构建以绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,脂质体介导稳定转染TT细胞,激光共聚焦显微镜观察外源性S100A13蛋白在细胞中的定位,采用real-time RT-PCR和Western blot鉴定稳定高表达S100A13基因的TT细胞系,细胞生长曲线、流式细胞术方法检测高表达S100A13基因对甲状腺癌TT细胞生长速率和细胞周期的影响。结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,成功建立了稳定高表达S100A13基因和空载体的TT细胞系TT-S100A13-GFP、TT-GFP。TT-S100A13-GFP、TT-GFP和TT细胞培养7天后细胞数目分别为(2.30±0.24)×105、(1.40±0.25)×105和(1.50±0.22)×105 (P0.05);TT-S100A13-GFP、TT-GFP和TT经流式细胞仪检测S期的细胞比例分别为6.47±0.14%、5.86±0.23%和5.99±0.28% (P0.05), G2/M期的细胞比例分别为50.27±0.66%、39.39±0.23%和39.64±0.64% (P0.05)。 结论:成功建立了稳定高表达S100A13基因的TT细胞系,高表达S100A13基因对TT细胞的生长具有促进作用,促进TT细胞从G0/G1期向S期及G2/M期过渡。 第三部分S100A13对TT细胞裸鼠移植瘤生长影响的实验研究 目的:通过建立裸鼠移植瘤模型,探讨S100A13对TT细胞裸鼠移植瘤生长的作用,初步阐明S100A13在甲状腺癌发生中的作用。方法:同时分别扩大培养稳定高表达S100A13的TT细胞(TT-S100A13-GFP)和空载体(TT-GFP)TT细胞及TT细胞,将三种瘤细胞接种于裸鼠背部皮下,通过测量三组裸鼠移植瘤体积、瘤重,评价S100A13基因转染对TT细胞裸鼠移植瘤生长的影响;采用免疫组织化学方法检测TT细胞裸鼠移植瘤中周期素E(Cyclin E)、FGF-1、血小板/内皮细胞黏附分子(CD31)蛋白的表达。结果:成功建立了TT-S100A13-GFP、TT-GFP及TT细胞裸鼠移植瘤模型。与TT-GFP及TT细胞组比较,TT-S100A13-GFP组裸鼠移植瘤生长速度明显增快、体积明显增大(第45天起有统计学差异,P0.05)。TT-S100A13-GFP组裸鼠移植瘤瘤重大于TT-GFP及TT组(P0.05)。TT-S100A13-GFP组裸鼠移植瘤中Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白表达明显强于TT-GFP及TT组(P0.05)。结论:S100A13的高表达能促进TT细胞裸鼠移植瘤生长;移植瘤中S100A13的高表达能增强Cyclin E、FGF-1、CD31蛋白的表达。 第四部分shRNA干扰S100A13基因对TT细胞释放FGF-1的影响 目的:探讨S100A13沉默对无血清处理TT细胞FGF-1释放的影响。方法:将S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门质粒转染TT细胞,应用Real TimePCR、间接免疫荧光法及Western blot方法检测细胞内S100A13基因及蛋白表达的抑制效率,应用间接免疫荧光及ELISA检测无血清处理TT细胞S100A13沉默后FGF-1释放变化。结果:S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门载体转染TT细胞后能够抑制S100A13基因及蛋白表达,抑制效率约为80%。间接免疫荧光法显示FGF-1主要位于细胞浆和细胞核,无血清培养6h胞浆内FGF-1基本消失。ELISA结果显示,S100A13沉默能降低无血清处理TT细胞培养上清中FGF-1的浓度(P0.05)。结论: S100A13-shRNA pENTRTM/U6入门载体能有效、特异性地抑制S100A13基因及蛋白表达;S100A13基因的沉默可以抑制FGF-1从细胞内释放到细胞外。 第五部分Ca~(2+)螯合剂对无血清处理TT细胞内S100A13和FGF-1释放的影响 目的:探讨Ca~(2+)螯合剂对无血清处理TT细胞内S100A13、FGF-1蛋白释放的影响,初步阐明Ca~(2+)在S100A13、FGF-1蛋白释放过程中的作用。方法:应用激光共聚焦显微镜实时动态检测细胞内、外Ca~(2+)螯合剂BAPTA-AM(2.5μmol/L)、EGTA(2.5mmol/L)对无血清处理TT细胞1h[Ca~(2+)]i的变化,采用Western Blot检测无血清处理0h、1h、2h、4h、6h细胞S100A13、FGF-1蛋白表达量,间接免疫荧光观察BAPTA-AM、EGTA对无血清处理6h细胞S100A13、FGF-1蛋白荧光分布的影响,Western Blot检测S100A13、FGF-1蛋白表达量,ELISA检测培养上清FGF-1蛋白浓度。结果:激光共聚焦Ca~(2+)荧光显像结果显示:正常培养的TT细胞[Ca~(2+)]i约0.1~0.3μmol/L,在扫描期间较稳定;无血清处理TT细胞[Ca~(2+)]i在23分钟内相对稳定,第23分钟后TT细胞[Ca~(2+)]i迅速上升出现Ca~(2+)波峰,达1.6μmol/L,第40分钟TT细胞[Ca~(2+)]i下降,40分钟至60分钟[Ca~(2+)]i约为0.3μmol/L—0.6μmol/L,1h内TT细胞平均[Ca~(2+)]i明显高于正常培养组(P0.05)。EGTA、BAPTA-AM能明显抑制无血清处理引起的TT细胞[Ca~(2+)]i升高,平均[Ca~(2+)]i与正常培养组差异无统计学意义(P0.05)。Western Blot结果显示无血清处理TT细胞S100A13、FGF-1蛋白表达量4h组、6h组均降低,0h、1h、2h三组间比较无统计学差异,4h组TT细胞S100A13、FGF-1蛋白表达与0h、1h、2h组差异有统计学意义(P0.05),6h组TT细胞S100A13、FGF-1蛋白表达与0h、1h、2h、4h组差异有统计学意义(P0.01)。间接免疫荧光结果显示无血清处理6h TT细胞内S100A13、FGF-1蛋白荧光强度较正常培养组明显减弱;EGTA、BAPTA-AM能拮抗无血清处理TT细胞内S100A13、FGF-1蛋白荧光变弱。Western Blot结果显示无血清处理6h TT细胞S100A13、FGF-1蛋白表达量较正常培养组明显降低,加入Ca~(2+)螯合剂EGTA、BAPTA-AM时TT细胞S100A13、FGF-1蛋白表达量与正常培养组无明显差异;上述各组细胞培养上清ELISA结果显示,无血清处理6h组TT细胞培养上清中FGF-1浓度较其它4组明显升高(P0.01)。结论:Ca~(2+)螯合剂能有效拮抗无血清处理引起的TT细胞[Ca~(2+)]i升高和S100A13、FGF-1蛋白的释放。


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