西地那非-H_2S释放剂（ACS6）对同型半胱氨酸损伤PC12细胞的拮抗作用及机制

【摘要】：【研究背景与目的】 同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是阿尔兹海默病的高风险因子,氧化应激是其神经毒性作用的机制之一。Hcy在自身氧化过程中会产生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS) ,从而诱导氧化应激和促凋亡。硫化氢(hydrogen sulfide, H_2S)不仅是体内重要的内源性神经调质,而且还是一种新的神经保护剂。它可通过清除活性氧,保护神经元对抗各种氧化应激损伤。此外,它还可通过激活ATP-敏感性钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)发挥神经保护作用。ACS6是一种新合成的西地那非-H_2S释放剂(H_2S-releasing sildenafil),研究证实H_2S的释放在这种新型H_2S供体的药理效应中起主导作用。 我们前期工作发现H_2S可通过清除活性氧(Reactive oxygen species, ROS)而对抗Hcy的神经毒性。基于此,本研究将以Hcy损伤PC12细胞为Hcy神经毒性的细胞模型,明确ACS6是否对Hcy的神经毒性也具有拮抗作用,并探讨其拮抗机制。 【方法】 采用亚甲基蓝比色法检测ACS6在细胞裂解液中H_2S的释放量;CCK-8法(Cell Counting Kit-8 assay)检测PC12细胞的活力;Hoechst 33258染色后,荧光显微镜下观察PC12细胞核染色体形态改变;碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色后流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)检测细胞凋亡率;罗丹明123 (Rhodamine 123, Rh123)染色后,FCM检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP) ; 2, 7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色后,荧光显微镜及FCM法检测细胞内ROS水平;Western blotting检测PC12细胞对氧磷酶-1 (Paraoxonase-1, PON-1)、细胞色素c (Cytochrome c, Cytc)、caspase-3、Bcl-2的蛋白表达;分光光度计法检测PC12细胞PON-1活性。 【结果】 1. ACS6对Hcy损伤PC12细胞的拮抗作用 ACS6在4～16μM范围内浓度依赖性地减轻Hcy (5 mM, 24 h)对PC12细胞存活率的抑制作用,ACS6 (16μM)能显著抑制Hcy (5 mM, 24 h)诱导PC12细胞释放LDH和细胞凋亡,表明ACS6对Hcy损伤PC12细胞具有拮抗作用。 2. ACS6拮抗Hcy损伤PC12细胞的机制 ACS6 (16μM)预处理30 min可减轻Hcy (5 mM, 24 h)引起的细胞内ROS的升高和PON-1蛋白表达及其酶活性的下降;PON-1特异性抑制剂2-羟基喹啉(2-hydroxyquinoline, 2-HQ)预处理30 min可取消ACS6对Hcy促进ROS累积和损伤PC12细胞的拮抗作用,表明ACS6的抗Hcy神经毒性作用可能与其上调PC12细胞PON-1表达和活性,抑制ROS生成有关。 ACS6 (16μM)预处理30 min可抑制Hcy (5 mM, 24 h)降低PC12细胞MMP、促进Cyt-c释放、激活Caspase-3和下调Bcl-2表达,表明ACS6可通过阻断Hcy激活线粒体凋亡通路而拮抗Hcy的神经毒性。 ACS6可缓慢持续释放H_2S,ACS6可对抗Hcy的毒性作用,而母体西地那非对Hcy的毒性作用无影响。此外,ACS6抗Hcy神经毒性的作用可被KATP通道特异性阻断剂格列苯脲(glybenclamide, GLY)阻断。以上表明ACS6抗Hcy神经毒性的作用依赖于H_2S释放及H_2S对KATP通道的激活。 【结论】 1. ACS6对Hcy损伤PC12细胞具有拮抗作用; 2. ACS6抗Hcy损伤PC12细胞的机理涉及到以下三个方面: (1)促进PC12细胞PON-1蛋白的表达及其酶活性、增强细胞的抗氧化能力,从而减轻Hcy诱导的细胞内ROS积累; (2)改善Hcy作用后PC12细胞的MMP水平、抑制Hcy对PC12细胞Bcl-2蛋白表达的下调作用,从而阻断Hcy激活线粒体凋亡通路; (3)释放H_2S,进而激活KATP通道。