LN与RCMECs对神经干细胞分化及VEGF、TGF-β表达的影响

【摘要】： 目的探讨层粘连蛋白(Laminin,LN )与脑微血管内皮细胞(Rat cerebral microvascular endothelial cells,RCMECs)对正常及缺氧条件下培养的神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化及VEGF、TGF-β表达的影响。 方法(1)采用胶原酶消化、贴壁细胞培养方法分离培养RCMECs,用光学显微镜及免疫细胞化学检测进行鉴定;(2)采用机械吹打、无血清完全培养基悬浮培养方法分离培养NSCs,用光学显微镜及免疫细胞化学方法鉴定NSCs及其分化后的细胞类型;(3)通过95%N2、5%CO2比率的缺氧气体培养NSCs 6h后建立缺氧损伤NSCs模型,采用MTT比色法、LDH检测缺氧损伤前、后细胞活性的变化,并采用免疫细胞化学方法比较缺氧损伤前、后神经元分化的情况;(4)实验分组:常氧组(NSCs+NSCs完全培养基)、缺氧组(缺氧NSCs+NSCs完全培养基)、常氧合培养组(NSCs+NSCs完全培养基+LN+ RCMECs)、缺氧合培养组(缺氧NSCs+NSCs完全培养基+LN+ RCMECs);(5)分别于6h、1d、3d、7d、14d等时间点用免疫细胞化学方法比较NSCs的分化情况及观察VEGF、TGF-β的表达。 结果(1)分离的RCMECs在体外培养一周左右生长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈“铺路石样”排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学测定阳性;分离培养的NSCs 6-7d光学显微镜下为大小均匀、折光性强、成圆球形悬浮生长的细胞球,免疫细胞化学Nestin染色呈阳性,用10%胎牛血清培养基可诱导分化为神经元、神经胶质细胞等神经细胞类型;95%N2、5%CO2比率的缺氧气体培养NSCs6小时后光镜下细胞球形状不规则,球体松散成棉絮状, MTT比色OD值缺氧前为0.37±0.35,缺氧后为0.27±0.23,差异具有显著性(P0.01),LDH+漏出量缺氧前为10.37±0.39unit/ml·min ,缺氧后为14.71±1.34unit/ml·min,差异具有显著性(P0.01);(2)正常NSCs神经元分化率为15.34%,缺氧培养6小时后神经元分化率为16.78%,差异无显著性(P0.05);(3)LN及RCMECs作用下,缺氧损伤NSCs分化为神经元比率较正常NSCs增加(P0.05);无LN及RMVECs时,VEGF、TGF-β等在正常NSCs及分化后的细胞几乎不表达,而在缺氧损伤NSCs及分化后的细胞表达阳性,LN作用下,缺氧损伤NSCs分化后的细胞与RCMECs形成血管样结构,从1天开始VEGF表达增强(P0.05),14天时,TGF-β的表达增强(P0.05)。 结论(1)NSCs缺氧培养6小时可以建立缺氧损伤NSCs模型,但短时间缺氧培养对细胞分化类型无明显改变;(2)LN及RCMECs可使正常及缺氧损伤的NSCs神经元分化比率提高;(3)缺氧可使NSCs免疫细胞化学VEGF、TGF-β表达阳性,在LN作用下缺氧损伤后的NSCs分化后的细胞和RCMECs可形成血管样结构,血管样结构形成与VEGF有关,晚期可能与TGF-β有关。