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二烯丙基二硫对转Chk基因人胃癌MGC803细胞G_2/M期的影响

陆丽峰  
【摘要】: 目的:二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)可诱导多种肿瘤细胞G2/M期阻滞,但其机制尚不十分清楚。本研究旨在建立稳定高表达Chk1、Chk2基因的人胃癌MGC803细胞株,进一步研究Chk1、Chk2在DADS诱导人胃癌MGC803细胞G2/M期阻滞中的作用。 方法:HE染色观察IC50值浓度的DADS对体外培养的人胃癌MGC803细胞形态的影响;Northern blot检测DADS处理MGC803细胞后Chk1、Chk2在mRNA水平的改变;免疫组化检测DADS处理前后MGC803细胞Chk1、Chk2蛋白水平的表达;利用脂质体将pcDNA3.1(+)/Chk1、pcDNA3.1(+)/Chk2导入MGC803细胞,经G418筛选出稳定转染Chk1、Chk2基因的细胞株,RT-PCR及Western blot技术检测表达产物。30mg·L-1DADS处理MGC803细胞及转Chk1、Chk2基因MGC803细胞后,流式细胞仪检测细胞周期分布情况;RT-PCR、Western blot及免疫组化检测Chk1、Chk2基因在mRNA水平和蛋白水平的变化。 结果:30mg·L-1DADS处理MGC803细胞12h后,与对照组相比较,细胞体积变小,散在分布生长,胞浆丰富,细胞核变小,染色变淡,部分细胞变圆,浮起于培养基中。Northern blot显示:Chkl和Chk2 mRNA水平在处理组与未处理组之间差异无显著性(P0.05)。免疫组化显示:30mg·L-1DADS作用MGC803细胞24h后,与对照组比较,Chk1、Chk2蛋白表达差异无显著性(P0.05)。 将重组质粒转染入MGC803细胞,G418筛选转染细胞4w后获得稳定转染重组质粒的MGC803细胞。经RT-PCR及Western blot鉴定,Chk1、Chk2在转染细胞中的表达明显高于对照组(P0.05),证实成功建立了Chk1、Chk2基因稳定高表达的MGC803细胞株。 流式细胞术显示:DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞、转Chk1、Chk2基因MGC803细胞于G2/M期,与对照组比较,差异有显著性意义(P0.05)。30mg·L-1DADS作用MGC803细胞及转Chk1、Chk2基因MGC803细胞12h,G2/M期细胞分别达26.4%、41.3%及24.4%,较对照组(6.9%、9.4%、8.6%)显著升高。24h时,G2/M期细胞进一步增加到51.5%、57.5%及45.5%,较对照组(9.8%、9.2%、10.2%)差异有显著性(P0.05);作用36h时,G2/M期细胞达63.6%、68.9%及57.1%,与对照组(8.6%、12.1%、9.1%)相比差异有显著性(P0.05);48h后,G2/M期细胞为25.0%、41.9%及25.3%,仍明显高于对照组(P0.05)。 免疫组化显示:30mg·L-1DADS作用转Chk1、Chk2基因MGC803细胞24h后,与对照组比较,Chk1、Chk2蛋白表达无明显改变。 RT-PCR显示:30mg·L-1DADS处理转Chk1、Chk2基因MGC803细胞12h、24h、36h、48h后,与对照组比较,Chk1、Chk2mRNA表达差异无显著性(P0.05)。 Western blot表明:30mg·L-1DADS作用2h、4h、8h、12h后,Chk1/Chk2总蛋白表达分别在两种细胞处理前后差异无显著性(P0.05),而转Chk1基因MGC803细胞p-Chk1表达明显增加,并呈时间依赖性(P0.05),但转Chk2基因MGC803细胞p-Chk2表达差异无显著性(P0.05)。 结论: 1.成功建立Chk1、Chk2基因稳定高表达的人胃癌MGC803细胞株。 2.Chk1高表达可以促进DADS诱导MGC803细胞G2/M期阻滞作用,其机制与Chk1磷酸化增强有关。


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