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氨氯地平经NF-κB通路下调人脐静脉内皮细胞PDGF-B的表达

何谨  
【摘要】:一、PDGF-B在ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞中表达的改变 目的通过氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用人脐静脉内皮细胞,观察随着ox-LDL浓度和时间的变化, PDGF-B mRNA和蛋白质的表达改变。 方法实验采用不同浓度(0,25,50,100 mg/L)ox-LDL与HUVEC-12内皮细胞共同孵育24h,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分别检测PDGF-B mRNA和蛋白质的表达改变;然后选择50 mg/L ox-LDL与HUVEC-12细胞孵育不同时间(0,3,6,12,24h)后,同样用RT-PCR和Western blot分别检测PDGF-B mRNA和蛋白质的表达改变;筛选出ox-LDL对PDGF-B表达影响适宜的处理浓度与时间。 结果随ox-LDL浓度增加,PDGF-B mRNA和蛋白质的表达趋势一致,先逐渐上调,当浓度为50 mg/L时,表达水平达峰值,但当浓度为100 mg/L时,表达下降。结合文献和我们的实验结果,以下选择ox-LDL的处理浓度为50 mg/L。随着ox-LDL处理时间的延长,PDGF-BmRNA和蛋白质的表达逐渐增加,在24h时,达最大值。因此在后续实验中选择50mg/L ox-LDL刺激HUVEC-12内皮细胞24小时,作为促进PDGF-B表达明显上调的最适浓度与时间。 结论Ox-LDL可影响HUVEC-12内皮细胞中PDGF-B的表达 二、氨氯地平对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞PDGF-B和NF-κB表达的影响 目的观察不同浓度(0,0.1,1.0,10.0μM)氨氯地平对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞中PDGF-B和NF-κB的表达改变。 方法在第一部分实验基础上,我们选择ox-LDL的处理浓度与时间分别为50 mg/L和24小时,实验分为5组:对照组、ox-LDL组、(0.1,1.0,10.0μM)氨氯地平预先处理细胞30min后加入50 mg/L ox-LDL共同孵育24小时组。用RT-PCR和Western blot分别检测PDGF-B mRNA和蛋白质的表达及NF-κB的蛋白表达改变;筛选出氨氯地平影响PDGF-B及NF-κB表达的适宜浓度。 结果随着氨氯地平浓度增加,细胞PDGF-B mRNA和蛋白质的表达及NF-κB的蛋白表达均逐渐减少,并呈现浓度依赖性,当浓度为10.0μM时作用更明显。 结论氨氯地平可下调ox-LDL诱导的HUVEC-12内皮细胞中PDGF-B和NF-κB的表达。 三、氨氯地平和NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞PDGF-B和NF-κB表达的影响 目的观察氨氯地平和NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞PDGF-B和NF-κB表达的影响,以分析氨氯地平通过NF-κB通路对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞PDGF-B表达的作用。 方法在第二部分实验基础上,选择10.0μM氨氯地平和20μM PDTC分别预孵育HUVEC-12内皮细胞30min,再与ox-LDL共同孵育24h,共分为六组:对照组、ox-LDL组、PDTC +ox-LDL组、氨氯地平+ox-LDL组和PDTC、氨氯地平单独处理组, RT-PCR和ELISA分别检测细胞PDGF-B的mRNA和蛋白表达,Western blot与免疫细胞化学检测细胞NF-κBp65的蛋白表达。 结果氨氯地平可明显下调细胞PDGF-B mRNA和蛋白质的表达及NF-κB的蛋白表达,结果与NF-κB抑制剂PDTC的作用相近。 结论氨氯地平能通过抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞NF-κB途径下调PDGF-B的表达。


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