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内含子27碱基miRNA对内皮一氧化氮合酶调控机制的研究

黎媚媚  
【摘要】: 目的:本研究探讨内含子27碱基microRNAs(27nt miRNAs)及其多态性对内皮一氧化氮合酶(endothelialnitric oxide synthase,eNOS)表达的作用及机制。 方法:用人工合成的27nt miRNA相应的双链互补DNA片段,插入pSilencerTM 3.1- H1 neo表达载体,经测序鉴定后作为miRNA的表达质粒;用脂质体将27nt miRNA高表达质粒转染进人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells , HUVEC),经G418筛选获得阳性克隆后,用Northern blotting验证miRNA在稳定细胞系中表达,以建立miRNA高表达为遗传背景的细胞系。用RT-PCR技术和Western blotting分别检测该细胞系中eNOS、核转录因子转录激活蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)、刺激蛋白-1(stimulating protein-1,SP-1)、信号转导子与转录激活子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)的mRNA和蛋白表达情况。 结果:DNA测序分析表明插入载体的27nt miRNA无读码框移位和突变,Northern blotting验证27nt miRNA在细胞系高表达,表明质粒构建成功;RT-PCR及Western blotting结果显示在mRNA与蛋白水平上,高表达27nt miRNA均不同程度地抑制eNOS基因的表达。4种miRNA均对VEGF的表达没有影响。转录因子SP-1的表达主要在54 nt miRNA及其突变体的细胞系中受到抑制;AP-1的表达在转染27nt miRNA与54nt miRNA及其各自突变体的细胞系中均下降;STAT3的mRNA水平的表达主要在转染27nt miRNA与54nt miRNA突变体的细胞系中下降,STAT3的蛋白水平在54nt miRNA及其突变体细胞系中不表达。 结论: 1.内含子27nt miRNA明显抑制eNOS基因mRNA及其蛋白表达,其抑制效应与miRNA多态性有关。 2.转录因子SP-1、AP-1与STAT3参与27nt miRNA对eNOS的表达调节过程。 3.内含子27nt miRNA及其重复序列与突变体多态性对VEGF的表达没有影响。


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