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基于“治未病”思想的癌痛消方防治大鼠诱导性肝癌的实验研究

黄峰  
【摘要】:目的1.以不同浓度的二乙基亚硝胺(DEN)水溶液诱发肝癌大鼠模型,并通过成癌率及生存时间等指标,确定诱发肝癌大鼠模型的最佳浓度及时间。2.检测64ppm DEN诱导的肝癌大鼠模型在不同时间点Bax、Bcl-2、Survivin、Fas、FasL、Caspase-3等基因的表达情况,确定与肝癌形成有关的优势基因。3.通过分析癌痛消方(Aitongxiao major Prescription,ATXP)干预治疗后肝癌大鼠模型在不同时间点肝脏组织病理变化,及Bax、Bcl-2、Survivin、Fas、FasL、Caspase-3等细胞凋亡相关基因和蛋白的表达变化和原位细胞凋亡情况,探讨其防治原发性肝癌的机制。 方法1.SPF级雄性Wistar大鼠96只,随机分为4组,每组24只。各组动物分别以含DEN 40ppm、64ppm、80ppm的水溶液和纯净水饲养,自由饮用,连续16周。于实验第16周,各组动物随机取12只处死,取肝脏标本并进行HE染色,在光学显微镜下观察各组动物肝癌病理切片并统计成癌率。各组剩余的12只大鼠用于观察生存时间。2. Wistar雄性大鼠60只,随机分为造模组40只、正常对照组20只。造模组饲以含64ppmDEN的自来水,饲养16周后,改为饮用自来水;对照组自由饮用自来水。分别于4W、8W、12W、16W.18W随机取出造模组动物4只、对照组动物2只,断头处死,取肝组织进行病理及Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin、 Fas/FasL等基因表达分析。3.雄性Wistar大鼠40只,分为预防组和模型对照组,每组20只;动物以64ppm DEN饮水饲养,连续16周后,改为自来水。同时,自诱癌之日起,预防组予以ATXP灌胃(0.2g/100g),1/日每周连续用药6d,停药1d修整;模型对照组给药周期为18w。分别在4、8、12、16、8w,每组随机取4只大鼠断头处死,取肝组织(阳性部位)进行HE染色,观察癌组织的病理变化,并通过RT-PCR、SABC等方法检测肝组织Bax、Bcl-2、Survivin、Fas、FasL、Caspase-3等基因和蛋白的表达,并采用TUNNEL法检测肝细胞原位凋亡情况。 结果1.动物饲养18w后,80ppm组成癌率为91.16%,64ppm组为83.33%,40ppm组为0;80ppm组22w病死率为33.33%,26w病死率为100%,而64ppm组大鼠第22w病死率为0,26w病死率为16.67%,第30w病死率为100%;40ppm组在第30w病死率为16.67%。80ppm组和64ppm组成癌率,无显著性差异(p0.05);但在生存期方面,前者明显延长(p0.05)。 2.各时间点病理检测结果显示,大鼠肝组织存在肝损伤和病理损伤,经历肝脏炎症→脂肪病变→肝纤维化→肝硬化→肝癌的病程发展过程,同HBV病毒感染的病理一致。DEN处理的大鼠,各时间点肝组织中Bax、Bcl-2基因持续高表达,Survivin、Fas基因仅在第8w高表达;Fasl基因在第8w、12w、18w匀高表达;Casepase处于低表达或不表达水平。 3、RT-PCR结果:ATX干预过程可以全程下调survivin、Bcl-2基因的表达,上调casepase基因的表达,Bax仅在12w表达上调,Fas和Fasl在4w表达上调,其余时间点变化不明显 4.免疫组化结果:survivin、casepase-3. Fas/Fasl、Bax、Bcl-2蛋白表达和基因表达一致;对照组survivin在16w、18w表达明显。casepase-3蛋白在整个诱癌过程均表达较少;Bcl-2蛋白在诱癌早期就即有表达,在诱癌过程呈现持续高表达,18w达峰值;而Bax、Fas/Fasl蛋白在第8w表达量最高;预防组抑制凋亡基因survivin和Bcl-2在整个观察时间点表达均较对照组表达降低(p0.05);casepase-3和Bax蛋白在整个观察时间点表达均明显升高(p0.05);Fas、Fasl蛋白表达量在4w较对照组明显升高(p0.0)。 5.TUNEL结果:阴性对照组各时间点未见凋亡细胞;模型组在4w、8w.12w未见凋亡细胞,16w、18w存在少量凋亡细胞;预防组在4w未观察到凋亡细胞,8w、12w有少量凋亡细胞,而16w到18w凋亡细胞数量显著增多,细胞凋亡指数增高。与模型组相比,有显著性差异(P0.01) 结论1.64ppmDEN是一个诱癌用于药物疗效评价的大鼠肝癌模型较理想的条件。 2.DEN诱癌整个过程是以抑凋亡基因表达上调、促凋亡基因表达下调过程,提示肝癌诱导是一个细胞增殖活跃、凋亡相关基因受到抑制的过程。 3.ATX防治肝癌是通过下调凋亡抑制因子Bcl-2、survivin,上调凋亡因子casepase-3的表达,促进细胞凋亡,来实现抗癌作用的。


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