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葛根芩连汤治疗2型糖尿病的配伍规律及作用机制研究

李冰涛  
【摘要】:方剂是中医临床用药的基本形式,其核心是配伍,君臣佐使是方剂配伍原则,多成分多靶点协同作用是方剂的作用机制。然而,中药方剂有效成分不清、靶点不明,严重阻碍了中药方剂作用机制研究进展。“主病者谓之君”,即说明方剂君臣佐使配伍关系是方剂中药味与疾病的关系,又说明方剂配伍关系随疾病而变化。“药有个性之长,方有合群之妙”,方剂配伍规律及作用机制研究对方剂理论及方剂临床研究具有重要的意义。目前基于还原论和主要成分研究方剂配伍规律和作用机制的方法不能完全阐明方剂多组分多靶点协同作用的科学内涵。因此分析方剂的有效成分、探索方剂的作用靶点仍是方剂作用机制研究的重要科学问题。 葛根芩连汤出自《伤寒论》,属经典名方,配伍以葛根为君药,黄连、黄芩为臣药;甘草为佐使药,主治协热下利。今用于用于治疗湿热困脾型2型糖尿病,属经方新用。本文旨在集成均匀设计、数理统计、转录组学、代谢组学及分子对接技术阐述葛根芩连汤治疗2型糖尿病的配伍规律,探索葛根芩连汤治疗2型糖尿病的有效成分及作用靶点,阐释葛根芩连汤治疗2型糖尿病的作用机制。为葛根芩连汤临床和实验研究提供依据,也为方剂作用机理研究提供研究思路和技术方法上的借鉴。 1、葛根芩连汤饮片药材来源选择及质量控制 目的:为葛根芩连汤治疗2型糖尿病作用实验选取质量合格的药材来源。方法:根据实验选取8个药材饮片制造商的葛根饮片、黄芩饮片、黄连饮片、炙甘草饮片。按照药典要求控制药材水分,使用HPLC法检测药材中主要质量成分的含量,进一步应用指纹图谱的方法控制药材质量。结果:通过对比主要成分含量及水分含量对比,发现8批不同饮片制造厂家的葛根、黄芩、黄连、炙甘草药材质量及指纹图谱存在差异。北京双桥燕京饮片制造厂葛根(产地:河南,批号:912014)、黄芩(产地:北京,批号:911002)、黄连(产地:四川,批号:905024)、炙甘草(产地:内蒙古,批号:910018)饮片中水分分别是8.9%,8.0%,7.7%,8.8%,均低于药典水分为12%的规定。其主要成分葛根素、黄芩苷、小檗碱、(表小檗碱、黄连碱、巴马汀)、甘草酸、甘草苷的含量分别是3.05%,13.9%,6.16%,3.3%,1.58%,0.678%,均高于药典含量,指纹图谱对比不同产地药材指纹图谱相似;结论:北京双桥燕京饮片制造厂的葛根(产地:河南,批号:912014)黄芩(产地:北京,批号:911002)黄连(产地:四川,批号:905024)炙甘草(产地:内蒙古,批号:910018)水分、主要成分含量符合药典规定,为实验药材饮片。 2、基于均匀设计的葛根芩连汤治疗2型糖尿病的配伍规律研究 目的:分析葛根芩连汤治疗2型糖尿病的配伍规律。方法:大鼠高糖高脂饲料饲养一个月后,尾静脉注射25mg/kg链尿霉素复制大鼠2型糖尿病模型,注射链脲佐菌素(STZ)周每间隔3天检测一次大鼠空腹血糖值、连续两次。两次血糖均大于11.1mM大鼠视为2型糖尿病模型大鼠。使用U1s(154)均匀设计表设计葛根芩连汤15个配伍组.模型大鼠随机平均分18个组,分别是葛根芩连汤配伍1-15组、葛根芩连汤组、2型糖尿病模型组和二甲双胍组。加上空白对照组,实验共分19组。连续90天按1.2m1/100g灌胃给与实验大鼠相应药物,90天后测定大鼠血清FBG、Insulin、GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C。分别使用相关性分析、逐步回归及偏最小二乘法回归分析葛根芩连汤治疗2型糖尿病的配伍规律。结果:相关性分析显示葛根芩连汤中葛根药材量的变化与FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C变化显著负相关;逐步回归结果显示葛根芩连汤中葛根是主要药材、实验范围内最佳配方为葛根芩连汤14;偏最小二乘法分析结果显示葛根、黄连的量增加、黄芩甘草量减少有利于2型糖尿病FBG、TC、LDL-C的将下降,依据变量重要性系数,葛根芩连汤中药材重要性顺序是葛根黄芩黄连炙甘草。结论:主病者谓之君,葛根芩连汤治疗2型糖尿病配伍随疾病变化,依据治疗2型糖尿病相关性,葛根芩连汤应以葛根为君、黄连为臣、黄芩炙甘草为佐使。 3、基于代谢组学葛根芩连汤治疗2型糖尿病作用机制研究 目的:探讨葛根芩连汤治疗2型糖尿病作用机制及作用靶点。方法:大鼠饲养、造模、大鼠饲养、造模、分组、给药、指标选择及检测方法详见第二章方法学部分。通过药效与时效对比分析,确认葛根芩连汤14是试验范围内治疗2型糖尿病大鼠最佳配伍。取大鼠血浆样本,血浆样本经加三倍甲醇进行去蛋白处理,应用LC-MS-QTOF对血浆中内源性物质检测,主成分分析(PCA)及数理统计方法分析葛根芩连汤14对2型糖尿病模型大鼠血浆整体状态的影响,探索其生物标记物。结果:给药三个月后,葛根芩连汤14显著降低2型糖尿病大鼠血清中的FBG、Insulin、HOMA-IR、GSP、TC、TG、LDL-C的含量,治疗2型糖尿病。改善2型糖尿病模型大鼠血浆中内源性物质胰岛素抵抗的状态,基于数理统计分析方法发现血浆亮氨酸及鞘氨醇1-磷酸在糖尿病模型组升高,葛根芩连汤14给药后其含量显著下降。结论:葛根芩连汤通过对亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸代谢途径影响治疗2型糖尿病,亮氨酸可能是葛根芩连汤治疗2型糖尿病的生物标记物,PPARγ可能是葛根芩连汤治疗2型糖尿病作用的靶点。 4、基于转录组学葛根芩连汤治疗2型糖尿病的作用机制研究 目的:探讨葛根芩连汤治疗2型糖尿病改善肝胰岛素抵抗分子机制及作用靶点。方法:大鼠饲养、造模、分组、给药、指标选择及检测方法详见第二章方法学部分。通过药效与时效对比分析,确认葛根芩连汤14是试验范围内治疗2型糖尿病大鼠最佳配伍,取大鼠肝组织采用转录表达芯片进行转录谱差异研究,表达量呈现两倍以上差异基因进行单个验证。并采用人肝胰岛素抵抗细胞模型进一步验证。结果:给药三个月后,与模型组相比,葛根芩连汤14组20多个肝基因表达出现显著差异,多与糖脂代谢相关。13个与糖脂代谢及炎症反应基因已被单基因检测证实。重要肝基因PPARα、CEBPα、和SREBP-1C表达上升,胰岛素作用IRS2介导的P13K的信号转导途径被修复,在体外人肝IR细胞模型上得到进一步证实。采用PPARα特异拮抗剂GW6471显著下降下游IRS2和GLUT1基因表达。结论:葛根芩连汤组通过调节糖脂代谢干预胰岛素作用的IRS2/PI3K信号通路改善肝IR治疗T2DM, PPARα是重要的调控节点。 5、基于分子对接技术的葛根芩连汤治疗糖尿病有效成分预测. 目的:应用分子对接技术预测葛根芩连汤治疗2型糖尿病的物质基础,探索葛根芩连汤治疗2型糖尿病的有效成分。方法:受体靶点来源于转录组学和代谢组学实验结果,其晶体结构来源与蛋白数据库,分子对接前靶点经去水,加氢,去配体处理,药材化学成分及结构来源于中药成分联合数据库和pubmed化学成分数据,对接前药材中化学成分进行能量最低化处理,分子对接使用sybyl2.5软件。结果:葛根芩连汤原药材中黄酮类和生物碱类与PPARα及PPARγ激动剂配体具有良好的结合能力。结论:黄酮类和生物碱类成分可能是葛根芩连汤治疗2型糖尿病的有效成分。


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