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基于内质网应激探讨脑泰方对局灶性脑缺血的干预作用及其可能机制

石咏梅  
【摘要】:目的:基于内质网应激采用动物实验和细胞实验研究中药脑泰方对局灶性脑缺血后的干预作用和机制,进一步明确脑泰方治疗缺血性脑中风的科学依据。方法:1.动物实验:(1)中药NTF干预MCAO术后大鼠,采用Longa评分法进行神经行为学评分,TTC染色检测脑梗死面积并计算面积百分比,Nissl染色观察缺血侧脑组织神经元的存活情况。(2)免疫组织化学方法检测MCAO术后不同时间点海马内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK和CHOP的表达,western-blot检测p-PERK、GRP78和CHOP蛋白的表达量,RT-qPCR检测不同时间点GRP78和CHOP基因的表达情况。2.细胞实验:(1)人工分离培养的大鼠(胎鼠)海马神经元和培养的HT22系小鼠海马神经元,OGD方法造模,MTT检测神经元存活率,同时在相应时间点观察神经元的存活和生长情况。(2)Western-blot检测相应时间点HT22系小鼠海马神经元内质网应激相关蛋白ATF4和cATF6的表达。3.数据分析:实验数据用SPSS18.0统计学分析,计量数据用均数士标准差(?X士S)来表示,多组样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析,组间两两比较方差齐者用LSD法,方差不齐者用Dunnet T_3检验,P0.05表示差异有统计学意义。结果:1.动物实验结果显示:(1)神经行为学评分结果显示,与假手术组相比,模型组评分升高,差异具有显著性(P0.05)。与模型组相比,各剂量脑泰方和尼莫地平可降低MCAO术后6小时的神经行为学评分,差异具有显著性(P0.05),且高剂量组与低剂量组和中剂量组相比作用更显著,差别具有统计学意义(P0.05);(2)形态学观察:TTC染色显示假手术组基本无梗死区,模型组与假手术组相比,梗死区明显,差异具有显著性(P0.05)。与模型组比,各剂量脑泰方和尼莫地平可以显著降低MCAO术后梗死区的面积百分比,差别具有统计学意义(P0.05);Nissl染色显示,模型组单位面积内存活海马神经元数目少于假手术组,差异具有显著性(P0.05);与模型组相比,各剂量脑泰方和尼莫地平可显著增加MCAO后单位面积内海马神经元的存活数量,差别具有统计学意义(P0.05)。(3)免疫组织化学显示,与假手术组相比,模型组自术后6小时GRP78蛋白表达水平逐步上调,至24小时达高峰,72小时后显著下调,差别均具有统计学意义(P0.05)。与模型组和尼莫地平组相比,脑泰方干预后,GRP78表达明显上调(P0.05);与假手术组相比,模型组p-PERK蛋白的表达6小时较高,随后开始下调,差别具有统计学意义(P0.05)。而脑泰方干预后,术后12小时开始p-PERK蛋白的表达显著高于模型组和尼莫地平组并维持在高水平,差别具有统计学意义(P0.05)。与假手术组相比,术后模型组CHOP蛋白的表达随着时间逐渐增强,差别具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,脑泰方从术后12小时开始显著抑制CHOP蛋白的表达,差别具有统计学意义(P0.05),并且显著低于尼莫地平组(P0.05)。(4)Western-blot结果显示,与假手术组相比,模型组GRP78、p-PERK及CHOP蛋白的表达都显著升高,差别具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,脑泰方可以上调MCAO术后GRP78蛋白的表达,差别具有统计学意义(P0.05),同时从术后12小时开始促进p-PERK的表达,差别具有统计学意义(P0.05),而CHOP的表达则被明显下调,差别具有统计学意义(P0.05)。(5)RT-qPCR结果显示,与假手术组相比,模型组GRP78基因的表达上调至24小时达高峰随后下调,差别具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,脑泰方从12小时开始促进GRP78基因的表达,差别具有统计学意义(P0.05);与假手术组相比,术后模型组CHOP基因的表达随时间逐渐增强,差别具有统计学意义(P0.05);与模型组相比,脑泰方在术后24小时开始显著抑制海马内CHOP基因的表达(P0.05)。2.细胞实验结果显示:(1)与正常培养神经元相比,OGD模型组胎鼠海马神经元MTT检测的MTT值从造模后12小时开始显著下降(P0.05);与OGD模型组相比,脑泰方从OGD后12小时开始提高胎鼠海马神经元的MTT值,差别具有统计学意义(P0.05)。与正常培养的小鼠HT22海马神经元相比,OGD模型组神经元的MTT值从造模后24小时显著下降(P0.05);与模型组相比,脑泰方从OGD后24小时开始提高HT22小鼠海马神经元的MTT值,差别具有统计学意义(P0.05)。(2)培养的HT22小鼠海马神经元ATF4蛋白在OGD后6h的表达量与正常培养神经元没有明显差别,但从OGD后12小时开始与正常培养神经元相比逐渐升高,差别具有统计学意义(P0.05)。脑泰方血浆干预后,ATF4的表达在12小时后与模型组相比明显下降,差别具有统计学意义(P0.05)。培养的HT22小鼠海马神经元cATF6蛋白在OGD后6小时的表达量与正常培养神经元没有明显差别,但从OGD后24小时开始与正常培养神经元相比显著升高,但至72小时又有所下降,仍略高于正常对照组,差别具有统计学意义(P0.05)。脑泰方血浆干预后,cATF6蛋白的表达在OGD后24h内都明显高于模型组(P0.05)。结论:脑泰方可能通过调控内质网应激PERK通路及ATF6通路,抑制凋亡因子CHOP的表达发挥神经保护作用。


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