何首乌中二苯乙烯苷的灵芝菌转化研究

【摘要】：目的:以灵芝菌为转化菌种,建立二苯乙烯苷与灵芝菌的双向发酵体系,通过对其转化产物及代谢酶的研究确定其转化机理,同时通过细胞毒性实验对转化产物进行安全性评价,促进中药材何首乌的进一步开发利用以及为含二苯乙烯类化合物中药材的减毒研究提供示范。方法:本研究选择药食两用灵芝菌作为转化二苯乙烯苷的菌种;通过考察不同温度、转速、接种量、底物浓度及瓶装量6个因素对转化的影响,建立灵芝菌转化二苯乙烯苷的最佳发酵体系;将收集得到的发酵样品进行萃取、浓缩、干燥、复溶等前处理操作后,采用凝胶色谱法、薄层色谱法对转化产物进行分离和纯化,利用NMR及MS等技术对产物进行结构鉴定;以转化终产物为基础,选用现代仪器分析技术HPLC-DAD-MSn对转化过程中的成分变化情况进行动态监测,确定二苯乙烯苷在灵芝菌中的转化途径和物质代谢过程,推测参与生物转化的酶;制备灵芝菌酶抽提液,定位转化酶在灵芝菌胞内外的分布情况并测定其活性;在转化体系中加入转化酶抑制剂和激活剂,观察转化情况,验证转化机理;通过体外模拟转化全过程,进行转化机理的进一步验证;最后通过比较发酵前后的样品对细胞形态的影响及MTT细胞毒性实验检测发酵后样品的毒性。结果:通过单因素考察确定温度为28℃,转速为180r/min,接种量为2.5%,瓶装量为30%,底物浓度为1.5mg/mL时转化效率最高,大约36h可以转化完全,且在6～27h灵芝菌对二苯乙烯苷的转化呈线性关系;将收集的样品经凝胶色谱柱分离纯化后MS、NMR鉴定代谢终产物为对羟基苯甲醛;不同时间点样品的HPLC-DAD-MSn检测结果表明二苯乙烯苷的物质代谢过程为:1)二苯乙烯苷→苷元+葡萄糖;2)苷元→对羟基苯甲醛+2,3,5-三羟基苯甲醛。灵芝菌中参与葡萄糖苷类化合物脱糖基的酶主要是β-D-葡萄糖苷酶,而断裂二苯乙烯母核中共轭双键的关键酶是木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase,简称Lip.);灵芝菌的粗酶抽提液转化实验发现仅胞外酶液能转化二苯乙烯苷,且同时在胞外酶液中检测到β-D-葡萄糖苷酶及Lignin Peroxidase的活性,据此可知参与二苯乙烯苷转化的两种酶均为胞外酶;此外通过向粗酶提取液中添加Lip.专属性抑制剂(300mmol/L的氯化钠)和激活剂(10mmol/L的藜芦醇),结果表明300mmol/L的氯化钠能部分抑制其活性,而10mmol/L的藜芦醇能激活该酶活性,由此确定参与二苯乙烯苷双键断裂的酶为木质素过氧化物酶;通过在培养体系中加入底物(二苯乙烯苷)和酶系(β-D-葡萄糖苷酶和木质素过氧化物酶),检测发现产物与灵芝菌发酵产物基本一致;此外在细胞毒性实验中发现加入未发酵的二苯乙烯苷细胞形态发生改变且细胞生长抑制率高,而加入发酵后的二苯乙烯苷样品细胞形态是正常的且细胞生长抑制率明显降低,由此可见二苯乙烯苷经过发酵后能降低细胞毒性。结论:灵芝菌可以有效地降低中草药何首乌中毒性成分二苯乙烯苷,灵芝菌与二苯乙烯苷双向发酵体系的建立及其转化机理的研究为灵芝菌在中药减毒领域的研究提供了理论依据,同时也为中药双向发酵技术的减毒提供典范,为何首乌等有毒中药材的开发利用提供了有效途径。