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寿胎丸对RSA大鼠子宫蜕膜AQP1、AQP6基因表达的研究

戴瑄  
【摘要】:目的:用免疫荧光法检测复发性流产大鼠蜕膜中AQP1、AQP6的表达情况,阐明寿胎丸对复发性流产大鼠子宫蜕膜组织中水通道蛋白的影响;从“肾主水”与母胎界面液体转运的角度探讨寿胎丸防治复发性流产的可能作用机制,为中药防治反复自然流产提供新的思路和理论依据。方法:1.造模选取8周龄、经检疫1周的健康性成熟且未经交配的SPF级SD雌性大鼠60只,体重为(216.09±8.49)g;30只10周龄,体重为(253.87±6.55)g的SPF级SD雄性大鼠,经过一周的适应性喂养后,按照雌鼠:雄鼠=2:1的比例进行合笼喂养,观察其交配情况,雌性大鼠次日早晨观察到阴道口有阴道栓脱落(即阴道口乳白色固体),阴道涂片镜下可见大量精子作为妊娠第1天。确定妊娠后,60只孕鼠按照随机数字表法分为6个组,并做好标记。妊娠的第1-9天每日上午,寿胎丸高、中、低三组及地屈孕酮组分别以相应药物灌胃;模型组和正常妊娠组孕鼠每日上午予以生理盐水灌胃。妊娠的第1-9天每天下午,正常妊娠组孕鼠予以生理盐水灌胃2m L/d,其余各组孕鼠均以羟基脲片水溶液灌胃(450mg/Kg)·2m L/d灌胃;妊娠第10天早上6组孕鼠均以米非司酮片剂水溶液灌胃(4.0mg/Kg)·2m L/d;在造模的第1、4、9天均需要测量孕鼠的体重。2.取材妊娠第11天将所有孕鼠断颈处死后,开腹分离孕鼠子宫,对各孕鼠的子宫的形态进行观察、记录,计算各组孕鼠的流产率,并分离胚胎着床部位的子宫蜕膜组织,用滤纸将蜕膜上残留的血吸净,然后固定备用。3.检测采用免疫荧光染色法进行制片并检测蜕膜组织中水通道蛋白1、6(AQP1、AQP6)的表达以及定位,用荧光显微镜电脑采像,其倍数为40*10倍。采用Image J软件进行图像分析,测量计算每个标本的IOD/Area值,以IOD/Area值作为半定量统计分析参数。结果:1.胚胎发育情况在孕鼠妊娠第11日(末次给药后24小时),将孕鼠断颈处死,开腹解剖分离出孕鼠的子宫。肉眼观察孕鼠子宫的形态:正常组:孕鼠子宫呈淡红色,胚胎组织大小一致,无竹节样改变,子宫腔内无明显淤血及淤点,着床点大小一致,胚胎组织未被机化;模型组:孕鼠子宫呈暗红色、部分呈暗黑色,胚胎组织大小不一,呈明显的竹节样改变,子宫腔内淤血明显,着床点可见淤血点,或较正常组着床点明显缩小,胚胎部分机化;地屈孕酮组:孕鼠子宫呈淡红色或暗红色,胚胎组织个别偏小,无竹节样改变,宫腔内偶见少量淤血点,着床点无明显缩小,胚胎组织未被机化;寿胎丸高剂量组、寿胎丸中剂量组、寿胎丸低剂量组三组情况基本一致,组与组之间存在细微差别:孕鼠子宫呈淡红色或暗红色,小部分胚胎大小不均一,无竹节样改变,宫腔内偶见淤血点,着床点无明显缩小,胚胎组织未被机化。2.各组孕鼠之间胚胎流产率的比较寿胎丸高、中、低剂量组,地屈孕酮组、模型空白组和正常妊娠组的流产率分别为:26.92%、29.70%、30.28%、27.27%、55.68%、8.25%。从;流产率来看:模型空白组流产率最高,正常妊娠组流产率最低,用药物干预的4组流产率从低到高分别是:寿胎丸高剂量组、地屈孕酮组、寿胎丸中剂量组、寿胎丸低剂量组。由此可见,就流产率而言,寿胎丸高剂量组较中、低剂量组及地屈孕酮组的效果明显。3.各组孕鼠蜕膜组织中AQP1、AQP6的表达差异AQP1的表达:与正常妊娠组比,模型组P0.01,差异具有显著统计学意义,提示模型组孕鼠子宫蜕膜中AQP1的表达较正常组而言有明显降低;进行药物干预后,与模型组比,寿胎丸高、中剂量组,地屈孕酮组均满足P0.05,差异有统计学意义提示寿胎丸高、中剂量组以及地屈孕酮组均能使RSA大鼠子宫蜕膜组织中的AQP1表达上升,其中寿胎丸高剂量组P0.01,差异具有显著统计学意义;与寿胎丸高剂量组比,寿胎丸中、低剂量组P0.05,差异有统计学意义,说明寿胎丸高剂量组比中、低剂量组对AQP1的表达作用强;与地屈孕酮组相比,寿胎丸高剂量组P0.05,说明寿胎丸高剂量对AQP1基因表达的改善高于地屈孕酮,寿胎丸中剂量组P0.05,说明寿胎丸中剂量组与地屈孕酮组都能提高AQP1基因表达,但二者的疗效相当。AQP6的表达:与正常妊娠组比,模型组P0.01,差异具有统计学意义,提示模型组孕鼠子宫蜕膜中AQP6的表达明显降低;进行药物干预后,与模型组比,寿胎丸高剂量组、地屈孕酮组均满足P0.05,其中寿胎丸高剂量组P0.01,提示寿胎丸高剂量和地屈孕酮均能使RSA大鼠子宫蜕膜组织中的AQP6表达上升;与地屈孕酮组相比,寿胎丸高剂量组P0.05,说明寿胎丸高剂量对AQP6基因表达的改善高于地屈孕酮。结论:1.寿胎丸能够改善RSA大鼠的宫内淤血情况,防止着床点的缩小,对流产子宫的竹节样改变有明显改善,有利于胚胎的着床,降低RSA大鼠的流产率;2.寿胎丸可能是通过改善RSA大鼠子宫蜕膜组织中AQP1、AQP6基因的表达来达到安胎的效果;3.RSA大鼠模型中AQP1、AQP6基因的表达,与寿胎丸剂量呈正相关,表明高剂量对AQP1、AQP6的上调更显著,但其安胎机制与剂量的相关关系仍需要进一步深入研究。


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