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密蒙花总黄酮对雄性去势大鼠干眼症的拟雄激素治疗效应的研究

王方  
【摘要】: 第一部分密蒙花总黄酮提取工艺的初步优化研究及本研究用药制备 目的:寻求最佳密蒙花总黄酮提取方法,使其总黄酮含量高于80%。 方法:采用醇提水沉法,后利用大孔树脂梯度洗脱的方法,在多次试验中摸索醇提水沉加水的倍数,以及大孔树脂洗脱的条件,确定密蒙花总黄酮最佳提取工艺。 结果:通过两次小试即确定了提取工艺。取密蒙花药材15kg提取,得到成品110g。从中取出两份成品平行样,进行HPLC检测,结果可见蒙花苷杂质已基本被洗脱,以已经制备的蒙花苷标准品溶液作为对照,用外标法计算,蒙花苷含量17.573%和17.011%,平均17.292%。通过已经确定的蒙花苷紫:外标准曲线计算,得总黄酮含量为81.488%。 结论:采用醇提水沉法后利用大孔树脂梯度洗脱的方法是提取密蒙花总黄酮较佳的方法,此法能使提取物的物质含量高于80%,符合V类新药标准,可用于本研究。 第二部分密蒙花总黄酮干预去势导致干眼症雄鼠泪腺BaxmRNA、bcl-2 mRNA及雄激素受体表达的研究 目的:建立大鼠雄激素水平下降所致干眼症模型;观察泪腺组织中AR上调情况,初步评价密蒙花总黄酮拟雄激素效应;观察泪液基础分泌量及泪膜的稳定性,透射电镜观察泪腺超微结构变化;观察密蒙花总黄酮对雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡是否有抑制效果。 方法:取健康一月龄Wistar雄性大鼠150只,体重0.2kg左右。采用随机数字法分为A1、B1、C1、D1、E1、A3、B3、C3、D3、E3、A5、B5、C5、D5、E5共15组,每组10只。A代表正常组;B代表假手术组;C代表模型对照组;D代表雄激素对照治疗组;E代表密蒙花黄酮治疗组;1代表饲养1个月;3代表饲养3个月;5代表饲养5个月。采用去势的方法建立雄激素水平下降所致干眼症动物模型。每组动物均由同一人检查,每组动物每次检查时间、地点、照明亮度、湿度及温度相同。分别于造模前、末次给药完成后进行Schirmer I试验(SIT)和泪膜破裂时间(BUT)检查。以SIT、BUT与正常组形成差异、角膜荧光染色记为(+)以上为异常。 结果:1.角膜荧光染色:A、B组角膜荧光素染色无明显改变;C组4个月后,角膜上皮开始进行性缺损,荧光素染色呈阳性,且随时间加重;D、E组分别灌胃4、6个月后,角膜荧光素染色点减少。2.各组SIT测量:C组(除C1组外)滤纸湿长缩短,与去势前差异有显著性(P0.05),随时间的延长差异无显著性(P0.05)。D组(除D1组外)滤纸湿长与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.05)。E组(除E1组外)滤纸湿长与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.05)。D5组与E5组比较差异有显著性(P0.05)。3.各组BUT测量:C(除C1组外)组泪膜破裂时间缩短,与去势前差异有显著性(P0.05),且随时间的延长差异有显著性(P0.05)。D组(除D1组外)泪膜破裂时间与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.05)。E组(除E1组外)泪膜破裂时间与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.05)。D5组与E5组比较差异有显著性(P0.05)。以上两个指标的变化说明干眼症动物模型成功;密蒙花总黄酮对雄激素水平下降所致干眼症有治疗效果,但随着病程的延长治疗效果降低,与雄激素治疗效果有差异。4.电镜结果表明:密蒙花总黄酮治疗组泪腺组织结构较模型组排列整齐,坏死、变性组织减少,细胞凋亡减少,炎症细胞逐渐消退。但随病程的延长其作用减弱,并与雄激素作用效果形成差异。5.AR及bcl-2 mRNA表达结果显示:C组(除C1组外)AR及bcl-2 mRNA表达升高,与去势前差异有显著性(P0.01),且随时间的延长差异有显著性(P0.01)。D组(除D1组外)与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.01)。E组(除C1组外)与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.05)。D5组与E5组比较差异有显著性(P0.01)。6. Bax mRNA表达结果显示:C组(除C1组外)Bax mRNA表达升高,与去势前差异有显著性(P0.01),且随时间的延长差异有显著性(P0.01)。D组(除D1组外)与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.01)。E组(除C1组外)与C组比较增长明显,差异有显著性(P0.05)。D5组与E5组比较差异有显著性(P0.01)。以上结果表明密蒙花总黄酮可上调泪腺中的AR,使AR的数量增加,但随病程的延长,其上调作用减弱,并与雄激素的上调作用形成差异;可使泪腺中bcl-2 mRNA表达增加,降低Bax mRNA的表达,但随病程的延长其作用弱于雄激素。 结论:1.采用改进的去势方法成功的建立了雄激素水平下降所致干眼症的动物模型。该方法对大鼠的损伤较小,简单,为进一步研究奠定了基础。2.大鼠泪腺组织中有雄激素受体。3.密蒙花总黄酮可上调雄激素水平下降所致干眼症泪腺组织中的雄激素受体表达量,产生与丙酸睾酮相同的效应,但随病程的延长其上调作用减弱,与雄激素的作用效果形成明显差异。4.密蒙花总黄酮治疗雄激素水平下降所致干眼症的机制可能与其产生拟雄激素效应后,对凋亡相关基因bcl-2 mRNA表达的上调和Bax mRNA表达的下调有关。 第三部分密蒙花总黄酮含药血浆干预干眼症细胞模型AR mRNA表达及STAT1磷酸化蛋白表达的影响的研究 目的:建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞模型;摸索含药血浆干预的最佳加入量;观察含药血浆对泪腺上皮细胞AR表达的影响;探讨如果含药血浆与AR结合,对于激活STAT1信号传导途径的影响;应用雄激素受体阻滞剂后用同样的方法检测各组细胞中AR mRNA表达,以及STAT1的磷酸化蛋白表达,以确定密蒙花总黄酮含药血浆是与AR结合,而非其他受体结合发生效应。 方法:取120只一月龄、体重150g-180g健康Wistar雄性大鼠的眶外泪腺,体外分离及培养泪腺上皮细胞。以H2O2诱导大鼠泪腺上皮细胞凋亡,建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡状态。制备含药血浆,以MTT法摸索干预细胞的最佳加入量;同时设立空白血浆组、密蒙花总黄酮含药血浆干预组、丙酸睾酮干预组,分别观察各组AR及STAT1磷酸化表达情况;并应用雄激素受体阻滞剂氟他胺,考察密蒙花总黄酮的拟雄激素效应。 结果:1.10d即可见培养的泪腺上皮细胞呈圆形或椭圆形,胞体肥大透亮,细胞核位于中央,胞膜清晰,生长较活跃。2.MTT法结果显示含药血浆最佳干预量为8.95×10-2。3.免疫印迹结果表明,含药血浆干预后,密蒙花总黄酮含药血浆干预组中AR的表达增强,与空白组间的差异有显著性(P0.01);丙酸睾酮干预组中AR蛋白的表达增强,与空白组间的差异有显著性,与密蒙花总黄酮含药血浆干预组相比差异有显著性(P0.01)。密蒙花总黄酮含药血浆干预组STAT1的表达量升高,与空白血浆干预组相比差异有显著性(P0.01);密蒙花总黄酮含药血浆干预组中STAT1表达量比丙酸睾酮干预组表达量低,但两者间的差异有显著性(P0.01)。含药血浆干预各组加入雄激素受体阻滞剂后,各组间的AR及STAT1磷酸化表达间无差异。 结论:1.采用改进的Ⅱ型胶原酶和反复贴壁法成功地体外分离和培养了大鼠泪腺上皮细胞。此方法提高了泪腺上皮细胞的纯度,方法实用,为进一步研究奠定了基础。2.泪腺上皮细胞中存在雄激素受体。密蒙花总黄酮含药血浆可与泪腺上皮细胞中的AR相结合,并非与其它受体结合,对泪腺上皮细胞中AR产生上调作用,而发生拟雄激素效应。3.密蒙花总黄酮含药血浆可通过与AR的结合促进STAT1的磷酸化表达,并激活STAT1细胞信号传导通路,而产生与丙酸睾酮相同的雄激素效应。


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