超微补阳还五汤对局灶性脑缺血模型大鼠神经元保护效应及机制研究

【摘要】： 背景:缺血性脑血管病是临床常见病、多发病,有病死率高、致残率高的特点,脑缺血后神经元损害是其病理机制的核心部分,因而探寻神经元保护剂是缺血性脑血管病的研究热点。补阳还五汤是治疗该类疾病的常用方剂之一,对缺血性脑血管病的治疗具有显著疗效和一定特色。 目的: (1)通过对超微补阳还五汤与传统补阳还五汤的有效成分的对比研究,探讨超微复方制剂的特点,为中药新型饮片的研制作出有益的探索。 (2)在建立局灶性脑缺血大鼠模型基础上,通过动物实验,探讨超微补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠神经元损伤的保护作用及其机制,为治疗脑梗塞的临床用药提供实验依据。 方法: (1)采用一系列试验对超微补阳还五汤与传统汤剂的有效成分进行对比研究。对当归、赤芍、川芎、红花、桃仁的主要有效成分进行薄层鉴别研究,并对主要成分进行含量测定;采用《中国药典》收录的相关方法检测重金属、砷盐含量以明确其安全性;对水溶性浸出物和正丁醇浸出物进行含量测定对比研究。 (2)采用栓线法复制MCAO大鼠模型,随机分成六组灌胃给药;在1天、3天、7天、14天四个时点观察各相应指标以探求超微补阳还五汤对脑缺血神经元损伤的保护作用及机制。对大鼠脑缺血损伤的保护作用选用行为学变化及组织形态学变化等指标,从对氧自由基的影响对其进行验证;对作用机制的探求从NGF及其受体(TRKA)的表达和信号转导机制(PI3K/PKB)两个方面进行。具体方法则为检测血浆SOD、MDA的活性变化,用免疫组化法和分子生物学方法观察对脑组织中NGF、TRKA及PI3K、CREB、AKT的表达的影响。 结果: (1)TLC测定各组供试样品在色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且复方超微补阳还五汤浸泡液中主要有效成分斑点较传统汤剂更明显,清晰;对其主要成分的含量测定显示超微补阳还五汤中黄芪甲苷含量与传统汤剂相当;对砷盐、重金属检测未发现其含量超标;对浸出物的测定显示超微补阳还五汤水溶性浸出物为传统汤剂水溶性浸出物的1.22倍,正丁醇浸出物为其传统汤剂的1.26倍,均高于传统汤剂。 (2)超微补阳还五汤可降低脑缺血损伤大鼠神经功能评分,并改善脑组织缺血的病理损伤,其作用明显优于模型组及假手术组;超微高剂量组作用优于传统汤剂组。 (3)超微补阳还五汤可提高脑缺血后血中SOD活性并降低MDA,其作用明显优于模型组及假手术组;超微高剂量组作用优于传统汤剂组。 (4)超微补阳还五汤可上调脑缺血后脑组织NGF及其受体TRKA的表达,并增强PI3K/AKT信号转导的表达,其作用明显优于模型组及假手术组;超微高剂量组与传统汤剂比较其影响有明显增高的优势。 结论: (1)补阳还五汤及其超微制剂可以改善局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损评分及脑组织病理变化,提高脑缺血后血液SOD活性并降低MDA活性以减弱氧自由基的毒性反应,对脑缺血神经元损伤具有保护作用。 (2)超微补阳还五汤保持了传统补阳还五汤中的有效成分,且有效成分的溶出相对传统汤剂更具优势。 (3)超微补阳还五汤可提高脑缺血后脑组织神经营养因子PI3K/PKB信号转导途径的表达,提高神经生长因子及其受体表达水平,这可能是超微补阳还五汤对脑缺血神经元损伤的保护作用机制之一。 (4)超微补阳还五汤以1/2等效剂量时即可达与传统汤剂相同的作用效果,以等效剂量时其作用效应有明显增加的趋势。 综上,本论文采用药物化学、药理学方法以及免疫组化、分子生物学方法,以超微技术对补阳还五汤复方制剂与传统补阳还五汤标准汤剂进行对照研究,论证了超微技术在促进中药复方制剂(补阳还五汤)有效成分溶出上的优势,并从神经营养因子通路(即信号转导机制)角度揭示了超微补阳还五汤的作用机制,具有显著的创新性。