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细胞色素P450酶活性分析及抑制机理研究

段俊敏  
【摘要】:肝脏细胞色素P450酶系(CYPs)负责人体90%以上的药物代谢。因此,运用体外代谢反应体系(如肝微粒体)获取肝药酶动力学参数以预测或外推药物在体内的生物转化行为,已成为当前新药研发中的一项重要内容。尤为关注的是CYP的机理性灭活(即自杀性抑制)或联合用药时多个共存组分对代谢酶清除能力的相互抑制所导致药物不良反应的风险日趋增大。如何准确、快速地测定和表征药酶催化活性的动力学参数和抑制机理,对候选化合物的类药性筛选、体内清除和药物间相互作用的评估十分重要。然而,目前大多数的CYP酶活分析方法都基于特征代谢产物的生成速率,并局限于单组分体系或简单抑制作用的测试与评价。传统方法不仅要求预先获得代谢产物标准品和较高的检测灵敏度,也不适合多组分或复杂药物相互作用体系的快速筛选。 针对现有CYP酶活分析方法的局限性,本文对底物消除法测定酶动力学参数的实用性进行了系统验证;建立了快速筛选中药复杂体系对人肝CYPs多酶体系抑制潜性的新方法;通过测定机理性抑制剂灭活参数推测了灭活作用的抑制机理。 论文主要工作如下: 1.基于高效液相色谱技术,以CYP的特异性底物非那西丁(CYP1A2)和右美沙芬(CYP2D6)为探针,比较底物消耗法和传统产物生成法测定肝微粒体酶催化动力学参数值的差异,评价底物消除法测定微粒体酶药物代谢动力学参数的可行性;并进一步探究了产生差异的原因,为合理使用底物消除法提供依据。 2.基于流动注射-质谱(FI-MS)直接检测技术,综合运用微孔板温孵、低温样品相分离、“6合1”进样、多探针同时定量分析手段,建立了一种适用于复杂中草药对人体主要P450酶(5种同工酶6个探针反应)活性的抑制潜性进行快速筛选与分类的新方法。进一步发现仅用两抑制剂浓度点测得的IC50值与通常七浓度梯度获得的IC50值相近,两点IC50测试的重现性良好。结合两点IC50测试程序减少样品数量,FI-MS/MS方法成功用于10种中药材粗提液对5种P450酶抑制效应的快速筛选与分类。 3.基于高效液相色谱技术,采用非那西丁为CYP1A2的特异性探针底物,考察机理性抑制剂(mechanism-based inhibitor)罗非考昔、噻苯咪唑单独存在时的酶活性与动力学参数Kinact和Ki值,并与两抑制剂同时存在时酶的动力学参数值进行比较,为推导灭活(inactivation)机理提供依据。


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