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rAAV8介导eNOS基因在HUVEC中的转导与表达

刘丽  
【摘要】:目的: 构建含有胎儿肉瘤样酪氨酸激酶-1(Flt-1)的内皮特异性启动子和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的重组腺相关病毒载体的包装质粒(pAAV-F1t-1-eNOS),并包装6型和8型重组腺相关病毒,体外转导培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),观察其在HUVEC中的基因表达。 方法: 1、重组pAAV-F1t-1-eNOS的构建 以现有质粒pFlt-1-1uc为模板,用PCR合成含有酶切位点的Flt-1基因片段,酶切Flt-1片段及现有质粒pAAV-MHC-TnT-GFP,连接构建成质粒pAAV-F1t-1-GFP;以现有质粒pCMV6-XL6-eNOS为模板,用PCR合成含有酶切位点的eNOS基因片段,酶切eNOS基因片段及已构建质粒pAAV-F1t-1-GFP,连接得到重组质粒pAAV-F1t-1-eNOS. 2、F1t-l启动子和eNOS基因表达活性的验证 将pAAV-F1t-1-GFP及pAAV-D(+)-CMV-GFP分别转染HUVEC及293细胞,24h后在荧光显微镜下观察GFP的表达;pAAV-F1t-1-eNOS转染293细胞,Western B10t检测eNOS的表达。 3、rAAV-F1t-1-eNOS病毒的包装 将pAAV-F1t-1-eNOS载体质粒,含Rep、Cap基因的包装质粒pXX8和pXX6,辅助质粒pHe1per,用三质粒共转染的方法转染293细胞,纯化病毒后用Real-Time PCR法检测病毒滴度,SDS-PAGE检测病毒纯度。 4、rAAV-F1t-1-eNOS表达检测 将rAAV-F1t-1-eNOS病毒感染HUVEC48小时后,收集细胞,用Western B10t检测eNOS的表达。 结果: 1、成功构建了pAAV-F1t1-eNOS包装质粒。 2、pAAV-F1t-1-GFP.pAAV-F1t-1-eNOS在293细胞中表达正常。 3、成功的包装了rAAV6-F1t-1-eNOS和rAAV8-Flt-1-eNOS两种病毒,滴度分别为3.14×1011v·g·/ml和1.12×1012v·g·/ml 4.rAAV-Flt-1-eNOS能在HUVEC中正常表达。结论: 1、rAAV6-F1t-1-eNOS和rAAV8-Flt-1-eNOS均能诱导在外源基因在细胞中的正常表达,Flt-1启动子可以驱动eNOS基因在HUVEC中的特异性表达,在体外实验研究中,rAAV6载体的表达效果明显优于rAAV8。 2、本实验中rAAV8-Flt-1-eNOS的成功构建将为实现以重组AAV病毒为载体的血管内皮细胞的靶向性基因治疗提供了新的思路。


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