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成人原代肝细胞的分离、鉴定及其蛋白质合成与P450表达

覃玉燕  
【摘要】:目的:探讨手术切除的成人良性病变肝叶的肝细胞分离及细胞鉴定技术,研究成人原代肝细胞培养过程中的细胞活力的改变,及蛋白质合成与细胞色素P450表达的变化。方法:选择肝脏良性病变的手术切除肝叶标本,采用改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞,用血球计数板计数法对分离后的新鲜肝细胞计数,台盼蓝拒染法检测新鲜肝细胞活率;利用过碘酸-schiff(PAS)反应来检测肝细胞的糖原合成能力,并利用免疫组织化学方法来测定肝细胞角蛋白CK18的表达联合判断肝细胞纯度;用CCK-8法检测连续培养7d肝细胞的细胞活力;全自动生化分析仪检测成人原代肝细胞在培养过程的白蛋白、尿素合成及相关生化功能指标;应用蛋白质印迹法(Western Blot)检测体外培养肝细胞细胞色素P450表达(生物转化反应第一相反应)。结果:1.新鲜分离的成人原代肝细胞数目大于109个,台盼蓝拒染法检测肝细胞活率达90%或以上。2.培养24小时后,肝细胞PAS糖原染色发现成人原代肝细胞内糖原被染成红色颗粒或片状,抗细胞角蛋白CK-18免疫组织化学染色发现CK-18在肝细胞内均匀分布,被染成棕黄色;糖原染色及细胞角蛋白CK-18联合鉴定肝细胞纯度达95%以上。3.CCK-8实验结果显示肝细胞培养第三天细胞活力处于最佳状态。4.培养的1周的过程中,肝细胞均具有良好的合成糖原、白蛋白和尿素的功能。5.培养过程中,ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趋势,在培养3天时达到最低,培养4天时开始上升,白蛋白的分泌量和尿素合成量在培养3天时达到最高,培养4天时开始下降。6.在离体培养1-7天中,肝细胞在80KD处均可见有细胞色素P450表达,并且在第3天表达最好。结论:1.改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞操作步骤简单,得到的肝细胞数目多、纯度高且具有完善的细胞功能。2.本研究所示肝细胞的细胞活力及细胞的生化性质均在培养的第3天时达到最好的状态。3.在离体培养1周的过程中,成人原代肝细胞均具有很好的细胞色素P450表达功能,且在第3天表达最好。


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