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拟南芥核糖体蛋白RPS9M基因的功能研究

鲁长青  
【摘要】:核糖体蛋白作为构成核糖体的重要组分,通过维持核糖体的稳定性、正常生物学功能来调控蛋白质的合成进而影响植物的各项生命活动。拟南芥核糖体蛋白在进化上是非常保守的,根据所处细胞位置不同分为胞质核糖体蛋白、叶绿体核糖体蛋白以及线粒体核糖体蛋白。目前,已经有一些研究对部分拟南芥核糖体蛋白在植物生长发育过程中的功能进行了阐述,但是拟南芥核糖体小亚基蛋白RPS9M在植物体内行使什么样的生物学功能还未见报道。因此,对RPS9M在拟南芥中的生物学功能进行研究将有助于人们加深对核糖体蛋白功能的了解,深化核糖体蛋白对植物生长发育调控机制的认识。本文以双受精关键调控因子ANK6为切入点,通过酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库,鉴定到RPS9M蛋白,并以RPS9M T-DNA插入突变体以及CRISPR/Cas9敲除突变体为材料,利用生物化学、分子生物学、遗传学以及细胞生物学等实验方法对该基因的功能进行分析,取得了如下结果:首先,酵母双杂交系统和双分子荧光互补系统(BiFC)都证实RPS9M蛋白能够与锚定蛋白ANK6相互作用,且相互作用发生在线粒体。RPS9M蛋白具有两个结构功能域,分别是位于C端的核糖体蛋白S9结构域和位于N端的非保守结构域。酵母双杂交显示,RPS9M蛋白的C端结构域主要参与与ANK6蛋白之间的直接互作,而N端结构域可以调控C端结构域互作的强弱。然后,对RPS9M蛋白的亚细胞定位进行了分析。结果清晰显示RPS9M定位于线粒体,表明RPS9M为一个线粒体核糖体蛋白。接着,对RPS9M的表达模式进行了分析。结果表明RPS9M主要在生殖发育过程中有很高的表达,且表达主要集中在胚囊以及花粉发育的各个时期以及受精后种子发育的前期阶段。同时在营养生长阶段也有一定量的表达,表达主要集中在根尖、幼叶等生长比较旺盛的部位。随后,对RPS9M基因缺失突变体,rps9m-1和rps9m-2进行表型分析发现这两个功能缺失突变体均无法获得纯合突变体,且角果内有接近一半的种子出现败育。正反交实验表明,RPS9M突变后雌配子体的传递效率只有3%左右,雄配子体的传递效率也受到严重的影响,只有21%作用。表明RPS9M在植物生殖发育过程中起着非常重要的作用;该基因突变后影响了雌、雄配子体的发育。紧接着对突变体花粉、胚囊的发育以及双受精和胚发育过程进行了分析+/rps9m-1突变体有大约30%左右的花粉败育,败育的花粉呈现个体缩小,形态皱缩,无细胞核存在,表面纹饰不清晰,萌发沟不明显等典型败育表型。对雌配子体发育进行分析发现突变体胚囊极核不能融合形成中央细胞核,中央细胞液泡发育缓慢,最终液泡体积比野生型小;说明RPS9M缺失会影响极核的融合以及中央液泡的发育。进一步的分析发现突变的胚囊对双受精过程中花粉管的吸引以及雌、雄配子的融合并无影响,但对随后的胚和胚乳发育产生严重影响。受精卵的发育基本停滞在合子或2细胞原胚阶段;胚乳发育则停滞在2-4胚乳核阶段,最终导致突变体种子败育。且种子败育的表型在授野生型花粉的条件下也无法恢复,说明种子败育的表型由胚囊缺陷引起。另外,从GABI-KAT拟南芥突变体种子库获得了一个RPS9M基因敲减(knock-down)的纯合突变体rps9m-3,RPS9M蛋白表达水平降低至正常水平的30%左右。对rps9m-3突变体进行表型分析,突变体同样具有花粉发育异常、胚囊发育缺陷等表型。大部分成熟花粉都具有3个细胞核,但花粉的形态出现畸形,且花粉在柱头上的萌发以及花粉管的生长均比野生型的缓慢。部分胚囊的发育也发生缺陷且表型比rps9m-1和rps9m-2胚囊的更严重。RPS9M突变后对胚和胚乳的发育以及胚形态建成过程中也产生影响。在种子发育过程中,rps9m-3突变体胚和胚乳的发育均比野生型缓慢,同一角果内各胚胎发育的一致性也受到影响。部分rps9m-3突变体胚的形态建成异常,早期胚胎发育过程中顶细胞的异常分裂以及胚柄顶端细胞的纵向分裂导致胚表皮原细胞层与内层细胞区分不明显,胚基部异常增大,胚辐射对称异常以及子叶原基的分裂异常最终导致子叶发育不完全或形成融合子叶或产生多片子叶。RPS9M突变对植株的生长也产生一定的影响。在种子萌发阶段,rps9m-3种子萌发比野生型缓慢且种子萌发率显著低于野生型种子;种子萌发后rps9m-3根的生长显著慢于野生型。在营养生长阶段,rps9m-3植株发育略晚于野生型,个体比野生型略小,叶片比野生型略小,抽薹后主茎比野生型弱。这些结果表明RPS9M突变后影响拟南芥种子的萌发,根、叶、茎的生长。最后,研究了RPS9 突变对线粒体功能的影响。对线粒体核糖体大小亚基rRNAs的含量进行了分析,结果显示rps9m-3突变体中线粒体核糖体26S rRNA与18S rRNA含量的比值出现明显的偏离,暗示着线粒体核糖体的功能发生紊乱。进一步分析发现,rps9m-3突变体内ROS含量明显高于野生型,且RT-PCR分析表明两个与线粒体功能紊乱以及ROS含量升高相关的指示基因AOX1a和NDB4的表达在rps9m-3突变体中显著上调。这些结果表明RPS9M突变影响线粒体的功能。综上所述,RPS9M不仅在植物的生殖发育过程中起着非常关键的作用,而且对根、茎、叶等营养器官的生长产生一定的影响。这些功能可能主要是通过RPS9M与锚定蛋白ANK6相互作用调节线粒体核糖体的功能,进而影响线粒体基因组基因的表达最终影响线粒体的功能来实现的。


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