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杀鲑气单胞菌的筛选及其细胞毒素的鉴定

刘智鹏  
【摘要】:杀鲑气单胞菌是多种淡、海水鱼类的主要病原菌之一,不仅给美国、欧洲各国造成了巨大的经济损失,同时也影响了包括中国在内的多个亚洲国家的多种鱼类养殖。筛选杀鲑气单胞菌菌株,鉴定其毒素,研究致病机理对于防治杀鲑气单胞菌具有重要意义。本研究利用稀释涂布平板法从草鱼的肠道内分离纯化出一株革兰氏阴性菌株,结合菌株的形态、生理生化特征与16S r DNA序列分析,鉴定为杀鲑气单胞菌,并命名为DBFF01。本文对DBFF01菌株的菌体形态、生长特性与抗生素敏感性进行了分析。通过对其进行全基因组测序,对样品进行数据统计和质控,包括质粒序列分析、碱基组成分析、Coverage统计、重复序列分析等。然后根据测序结果进行基因结构和功能注释,包含t RNA及r RNA预测、蛋白长度预测、COG功能注释分析、KEGG功能注释分析等。结果显示,过滤后的总数据量为794,967,393 bp,reads条数为59,244,平均reads长度在2,950 bp,GC含量为58.33%。鉴定出10套核糖体r RNA操纵子和129个t RNA,通过分析COG、KEGG等数据库,发现大部分基因主要与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、物质转运等相关。对比分析SWiss Prot数据库得到一种与苏云金芽孢杆菌以色列亚种Cyt1Aa毒素具有一定同源性的基因序列,命名为Cyt1Aa-like。对该潜在毒素蛋白进行了克隆、诱导表达以及纯化,将纯化后的蛋白作用于枞色卷蛾中肠细胞CF203/2.5发现,与对照组相比,细胞逐渐皱缩破裂发生聚集,细胞数目不断减少,随着蛋白作用时间的延长和浓度的增加,细胞毒性逐渐增强。结果显示该蛋白对于CF203/2.5细胞具有一定的毒性,具体作用机制有待进一步研究。本文对杀鲑气单胞菌进行了筛选、鉴定与测序,并克隆表达相关毒素蛋白,并研究了其细胞毒性,有利于进一步阐明杀鲑气单胞菌毒素的致病机理,为疖疮病的防治提供理论基础。


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