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黑曲霉植酸酶菌株选育及其酶的分离纯化和性质研究

程海娜  
【摘要】: 植酸酶(phytase EC3.1.3.8)能水解植酸而显示出在饲料、食品、医药等领域有着广泛的应用前景,在高产菌种选育及其酶学性质成为重点研究领域,但目前植酸酶制剂因价格昂贵,难以推广应用。本项研究的目的筛选出产植酸酶菌株,优化其产酶条件,对其进行诱变,提高产酶量,并对植酸酶分离纯化和研究其酶学性质,以利发展微生物酶学研究和为大规模发酵生产廉价的植酸酶制剂奠定基础。 1.植酸酶菌株的筛选及产酶条件的研究 本项研究利用植酸酶的菌株能在筛选培养基上形成水解透明圈的特点而进行鉴定,通过初筛和复筛,得到一株产植酸酶较高的黑曲霉(Aspergillus niger)AN00101菌株。对该菌的产酶条件进行研究的结果表明:麸皮固体培养基的最适加水量为35%;30℃培养90~120 h之间产酶都比较高,在114 h酶活最高;在提取时不仅pH对酶得率有影响,而且不同提取液所要求的最适pH也不同,用乙酸缓冲液提取时,当pH为5.5、6.5时酶活较高,进行水提取时,在pH7.5时酶活最高;利用CaCl_2溶液进行提取的浓度达到3%时,酶活最高。经L_9(3~4)正交实验表明,硫酸铵和硫酸镁对产酶有显著的促进作用,适宜添加量分别为4.0%和0.3%;产酶条件优化后,酶活高达1.3×10~4 U/g。 2.产植酸酶黑曲霉菌株的诱变选育 在对黑曲霉AN01001进行紫外线诱变后,酶活最高的A333菌株比对照高出43%。随后用紫外线和LiCl复合诱变酶活提高不大。最后,用亚硝基胍对产酶较高的3个菌株诱变,经复筛后,N28和N118的酶活比黑曲霉AN01001高出47.5%和40.9%,比A199高出29.5%和23.7%,N28和N118经过5次连续传代后,产酶能力基本稳定。 3.植酸酶的分离纯化及其性质研究 黑曲霉ANO 1001经固体发酵,用缓冲液抽提后,经硫酸按沉淀, DEAE一纤维素离子交换层析,聚丙烯酞胺凝胶电泳和电洗脱等纯化 步骤获得的植酸酶,用SDS一PAGE检测为一条均一谱带,其分子量约 为78 KD。该酶反应的最适PH值为5.5,在pHZ一6之间都有较高的 酶活性,pH大于6时植酸酶的活性迅速下降,在pHZ一8之间的稳定 性很好,活性70%。当pH8时,酶迅速失活,其反应的最适温度 为55℃。植酸酶在90℃处理15和30 min,其残留的酶活为75.9 %和62.3%。当胰蛋白酶与植酸酶比例为0.1时,37℃处理120 min 后,植酸酶残留的活性基本保持在67%。Ca2+、Mg2+、Mn2+、A13+对 酶无显著影响,Zn2+、Cu2+对酶有强烈的抑制作用。


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