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古尼虫草液体深层发酵及化学成分的研究

傅岚  
【摘要】:本文以产于湖南浏阳市的古尼虫草[Cordyceps gunnii (Berk.)Berk.]及深层发酵的古尼虫草菌丝体为实验材料,利用菌种分离技术,液体深层发酵、PCR、柱层析、纸层析、紫外、红外光谱技术和化学反应等手段,对古尼虫草菌丝体液体发酵培养条件及部分化学成分进行了研究,主要包括以下内容:古尼虫草液体种子培养基及培养条件的筛选,发酵罐深层发酵生长曲线的测定,古尼虫草子座和古尼拟青霉(Paecilomyces gunnii)ITS序列的分析,菌丝体多糖的分离纯化及结构测定,古尼虫草的碱溶性多糖、甘露醇的提取方法及含量研究,获得了如下结果: 1.优化筛选出了古尼虫草菌丝体最适液体种子培养基和最佳培养条件,培养基配方为:土豆汁20%、蛋白胨1%、葡萄糖2%、硫酸镁1‰、磷酸二氢钾0.5%0、磷酸氢二钾1‰;用三因素四水平的正交试验,获得其最佳培养条件:26℃,转速150 r/min,pH 6.5,时间以5d为宜。 2.测定了古尼虫草菌丝体发酵罐深层发酵的生长曲线,确定发酵周期以66h为宜,并根据其生长规律,将其分为四个典型生长时期:生长延迟期、对数生长期、稳定生长期及衰老期。 3.运用PCR技术研究了古尼虫草子座和菌丝体的完整的ITS区(ITS1+5.8S+ITS2),两者的PCR扩增产物电泳图谱及整个碱基序列完全一致,ITS1为207bp,5.8S为157 bp,ITS2为202 bp,可证明本文分离得到的古尼虫草菌丝体,确为古尼虫草的无性型古尼拟青霉;比较了古尼虫 草子座、菌丝与冬虫夏草的rrs序列,并认为它们具有较近的亲缘关系。 4.古尼虫草菌丝体经热水浸提、醇析、脱蛋白,得到粗多糖,再经 D王AE一52纤维素柱层析纯化得到纯多糖CG-1,经紫外光谱,柱层析等证 明其为单一成分,纸层析表明其单糖组分为葡萄糖,用高碘酸反应证明其 糖基是以(1。6)位糖若键型缩合,红外光谱结果显示CG-1具多糖特征 吸收峰,为Q一毗喃型葡聚糖。 5.用四因素三水平的正交试验确定了以35℃,加5倍量的0 75mol几 的NaOH溶液浸泡提取古尼虫草菌丝体sh,为碱溶性多糖的最适提取方 法,从每克菌丝体中提取的多糖最高可含41 .92mg。 6古尼虫草发酵菌丝体含有丰富的甘露醇,在每克干菌粉中含量为 60mg,每克古尼虫草子座中含量为61mg,每克僵虫体含量达105mg。


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