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蛋白磷酸酶PP1和PP2A在脊椎动物体内分化表达模式的研究

刘文彬  
【摘要】: 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是真核生物体内基本的调控机制。蛋白磷酸酶行使的去磷酸化作用在调控细胞内生命过程,如对细胞外信号的应答、激素的调节、生长因子、细胞因子、抗原及细胞内的信号,如与DNA损伤相关的信号及影响细胞周期的信号起了重要的作用。在真核生物中,丝氨酸/苏氨酸位点的去磷酸化,主要由4个蛋白磷酸酶PP1,-2A,-2B及-2C行使,尽管近年来其它蛋白磷酸酶PP4,-5,-6,-7也参与了这些活动过程,但主要的细胞内的蛋白磷酸酶的活性是PP1和PP2A的作用,研究者们估计80%以上蛋白质的去磷酸反应是由PP1与PP2A行使的。本文以金鱼、异源四倍体鲫鲤及其二倍体父/母本(湘江野鲤/红鲫)和子代三倍体湘云鲫、小白鼠等为实验材料,运用RT-PCR技术、Real-time PCR技术、Western blot技术及荧光免疫组织化学技术等实验手段,已经得到了PP1与PP2A的催化亚基在上述脊椎动物体内的表达模式,其结果如下: (1)克隆出了金鱼PP1a、PP1β、PP2A催化亚基的部分片段的序列,其长度分别为823bp,419bp,408bp,为后面进一步研究PP1c与PP2Ac在金鱼中的表达提供了实验基础。 (2)分子、蛋白及细胞水平的检测发现PP1c与PP2Ac在金鱼的肝脏、肌肉、卵巢、精巢、大脑、肾脏、心脏、鳃及尾鳍9种主要器官组织中均有表达,而且不同的组织,PP1与PP2A的表达水平出现了差异。从mRNA水平来看,PP1c在精巢中的表达最高,卵巢、肾脏、心脏、肝脏、大脑等组织中的表达次之,肌肉、鳃与尾鳍组织中的表达水平相对更低。而PP2Ac的表达水平在性腺中最高,肾脏中的表达次之,肝脏、大脑、心脏中的表达水平又稍低,肌肉、尾鳍与鳃组织中的表达水平最低。对于蛋白水平的表达,PP1c与PP2Ac在不同的组织中显示了明显的差异表达模式,最显著的特征是在肌肉和心脏组织中,PP2Ac表达很微弱或没有表达。 (3) PP1c和PP2Ac在金鱼胚胎发育过程中存在时间和空间的变化模式,Western blot检测结果显示,从囊胚期到出膜,随着胚胎发育的进程,PP1c与PP2Ac的表达含量逐渐上升,到出膜期达到最高峰。免疫组织化学分析表明PP1c与PP2Ac在金鱼胚胎不同发育阶段都有强烈的表达,运用抑制剂Calyculin A抑制PP1c和PP2Ac的活性,引起了囊胚期细胞的大量凋亡和胚胎的致死现象。 (4)异源四倍体鲫鲤及其二倍体父/母本和子代三倍体湘云鲫的大脑、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和性腺6种组织中,PP1c与PP2Ac同样都呈现明显的分化表达模式。并且表达模式与金鱼组织中是基本相同的,所以PP1c与PP2Ac在金鱼9种不同组织中的检测结果是真实可靠的。 (5)在小白鼠的肝脏、大脑、肾脏、心脏、肌肉、脾脏、卵巢、睾丸、乳腺、肺和胃11种不同组织中PP1c和PP2Ac都有表达,mRNA水平看,性腺和大脑中的表达相对较高,肝脏、脾脏、肾脏、心脏、乳腺等组织中次之,肌肉和胃组织中的表达相对较低。蛋白水平来看,大脑中表达相对较高,而卵巢、精巢、肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺和乳腺中表达次之,同样肌肉和胃中的表达相对最低。在不同组织中定位研究显示,PP1c与PP2Ac的表达同样具有组织特异性和细胞特异性。 (6)对于PP1c和PP2Ac在金鱼和小白鼠眼睛中的表达模式进行了仔细的研究,发现PP1c和PP2Ac在视网膜中都有较高的表达。然而,在小白鼠眼睛的角膜中,PP1c和PP2Ac的表达很高,而金鱼角膜中的表达最低。在金鱼和小白鼠眼睛的4个组织中,PP1c似乎是含量更丰富的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。对于受精48hr的金鱼胚胎和怀孕15天的小白鼠胚胎眼睛中的定位研究,发现在金鱼胚胎眼睛中,在上皮细胞与晶体纤维细胞中PP1c和PP2Ac表达非常高,但视网膜与角膜表达相对较低。小白鼠胚胎眼睛中的表达呈现相同的表达模式。 总之,从金鱼到小白鼠的大部分组织中,PP1c和PP2Ac都有较高的表达,而且所有的器官组织中均呈现明显的分化表达模式。PP1c和PP2Ac对胚胎发育的调控起着重要的作用,抑制PP1c和PP2Ac的活性导致了金鱼囊胚期胚胎的死亡。


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