中药中黄酮类化合物全定性分析策略

【摘要】： 中药是中华民族经历漫长历史而保存下来的民族瑰宝。20年前我国提出了中药现代化的口号,但因诸多原因,中药现代化之路并不顺畅。中药为众多化合物组成的复杂混合物,其药效为众多化合物的整体协同作用结果,仅仅分离并鉴定出几个常量成分并测定其生物活性不能真正阐明中药的药效基础。在本论文中,我们试图建立系列能对中药中的次生代谢产物黄酮(包括常量与微量组分)进行全定性分析的策略,以求更为确切地阐明相关中药的物质基础,从而有效地为其药效研究及质量控制提供依据。 在中药化学成分研究中,除了采用传统的植化分离方法外,基于联用技术发展起来的在线鉴定方法已得到广泛应用。两类方法比较而言,各有其优缺点：传统植化分离过程繁琐,且对于微量、不稳定及难分离物质的分离存在很大困难,但使用该方法得到的单体化合物能进行全面的波谱及理化性质表征,结构鉴定确切；在线鉴定方法简单、快速,且适合于微量甚至痕量化合物及不稳定和难分离组分的分析,但获得的结构信息常不全面。因此本论文的核心思路为利用传统植化分离技术与在线鉴定技术的优势互补性,采取相应措施,探讨实现中药活性成分的全定性分析的新方法。针对中药样品的实际情况,设计了两种全定性分析方案,分别用于化学物质背景不明确的中药样品(方案一)和化学物质背景较明确的中药样品(方案二)。本论文的主要目的为在以上思路的指引下,实现对中药黄芩根、黄芩茎叶及藏药唐古特青兰中的黄酮类化合物的全定性分析。具体内容包括以下五个方面。 1.基于乙腈／水体系加少量氯仿等疏水有机溶剂能诱导分相的现象,建立了一种中药中的黄酮类化合物提取分离的新方法：溶剂诱导相变萃取(solvent induced phase transition extraction, SIPTE)法。该方法集提取与分离于同一过程,能够将中药中的黄酮类成分按苷元与糖苷彻底地分成两部分,从而显著简化后续的精制过程。该方法为本论文所要建立的中药中黄酮类化合物的全定性分析策略奠定了重要分离技术基础。 2.在提出的中药活性成分全定性分析思路,“方案一”,的指导下,对重要中药黄芩根的黄酮类成分进行了准确的全定性分析。具体实施如下：第一步,HPLC-UV/MS分析,共有32个组分被检测且均被确定为黄酮类化合物；第二步,结合所建立的SIPTE法和传统柱层析法对其进行系统分离,获得18个常量组分的单体化合物,并进行波谱表征以确定结构；第三步,系统地研究各分离单体化合物的MS及UV行为；第四步,基于在线获得的UV及MS(MSn)数据对未得到单体化合物的13个微含量组分进行在线结构鉴定,从而最终实现黄酮根中黄酮类化合物的全定性分析。该工作在方法学上验证了我们所提出的中药活性成分全定性分析思路的实际可行性,而黄岑根中黄酮类化合物的全定性分析结果为更全面地阐明中药黄芩根的物质基础提供了强有力的支持,对黄芩根及相关产品的质量控制、安全评价、药效研究以及新产品的研发有着重要意义。 3.在所提出的中药活性成分全定性分析思路,“方案二”。的指导下继续对黄芩茎叶内黄酮类成分进行准确的全定性分析。具体实施如下：第一步,同样为HPLC-UV/MS分析,共有21个成分被检测并确定为黄酮类化合物,其中绝大部分为黄芩茎叶独有成分；第二步,根据上一章工作总结的各黄酮类化合物的UV特征及MS裂解规律,并参考大量文献,对黄芩茎叶内黄酮类化合物进行在线鉴定。共有17个组分结构得以成功鉴定；第三步,对另外4个无法在线鉴定的组分进行目标性分离制备和结构鉴定,从而最终实现了对黄芩茎叶内黄酮类组分的全定性分析,其中发现一个新化合物。在上一章工作的基础上,此工作还对黄芩茎叶中黄酮类化合物的MS及UV行为进行了补充研究,着重研究了二氢黄酮类化合物的MS及UV特征。本工作进一步验证了我们所提出的中药活性成分全定性分析思路的可行性,所得到的全定性分析结果对黄芩茎叶及其相关产品的质量控制及新产品的研发有着重要意义。 4.为更进一步考察全定性分析策略的可行性,采用“方案一”对藏药唐古特青兰中黄酮类化合物进行全定性分析。即第一步分析,第二步系统分离,第三步总结归纳各化合物UV及MS特征,第四步对难分离组分进行在线鉴定。总共有8个组分被检测并确定为黄酮类化合物,其中6个成分被分离纯化并通过波谱表征以确定结构,2个难分离组分得以成功在线鉴定。所鉴定的8个黄酮类化合物均为首次从唐古特青兰中报道。 5.鉴于传统的MSn结构鉴定方法尚不能确定黄酮类化合物取代基的具体取代位点,为此,本文建立了一种新的能精确确定黄酮类化合物羟基取代位点的质谱鉴定方法。在正ESI模式下,黄酮苷元分子离子产生系列C环裂解的i,jA+与i,jB+特征离子,这些离子较原苷元离子简单得多,且保存了完整的原黄酮苷元的A环或B环结构。我们以i,jA+及i,jB+离子的下一级CAD裂解对原黄酮化合物的A环和B环的具体结构分别进行鉴定。研究表明：所有类型黄酮类化合物的A环结构都可以通过1,3A+离子的下一级CAD裂解得以鉴定；黄酮类化合物的B环结构可以通过1,3B+离子的下一级CAD裂解得以鉴定；黄酮醇化合物的B环结构可以通过0,2B+离子的下一级CAD裂解得以鉴定。该工作进一步完善我们所建立的中药中黄酮类化合物全定性分析策略。