C17.2神经干细胞的质膜蛋白质组及其糖基化修饰研究

【摘要】： 神经干细胞(NSC)是神经系统中能够自我更新并具有多向分化潜能的细胞,在一定条件下能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。由于其具有高度的自我更新能力、低免疫源性、多潜能分化、迁移功能及良好的组织融合性等特性,因此可以作为基因或药物治疗载体以及修复许多中枢神经系统损伤或疾病。寻找参与神经干细胞分化相关新的信号通路,弄清神经干细胞多能性(自我更新或增殖)维持及分化所涉及的机制是神经干细胞研究的重要领域之一。神经干细胞在自我更新和分化的过程中,细胞质膜蛋白质作为外界微环境改变引起胞内信号传导的起始部位,起着举足轻重的作用。存在于细胞膜上的各类离子通道,抗原分子,及表面受体在细胞增殖、迁移、凋亡和分化过程中起着非常重要的作用。本实验旨在研究C17.2神经干细胞的质膜蛋白质。C17.2神经干细胞是在小鼠原代小脑的神经干细胞中转入v-myc基因构建成的永生化神经干细胞系。运用双水相方法获取C17.2神经干细胞的质膜,将质膜经裂解液裂解后进行SDS电泳,酶解,最后通过LC-MS/MS质谱分析鉴定以及生物信息学分析,共鉴定得到了222个质膜蛋白质。其中转运蛋白质含量最多,大量的受体、信号分子、酶类等也得到了鉴定。许多蛋白质如Presenilin-1, Nicastrin, Cell adhesion molecule 1等与神经干细胞的增殖与分化密切相关。本实验首次对C17.2神经干细胞的质膜蛋白质进行鉴定和分析,此数据对神经干细胞的增殖与定向分化以及退行性疾病修复等方向的研究提供了应用价值。 细胞膜蛋白中大部分都是经过糖基化修饰的蛋白质,糖链如细胞表面的天线,成为细胞相互识别、粘着、信号接收、通讯联络、免疫应答等的分子基础,已知的多种疾病标志性分子和重要的抗体分子都是膜糖蛋白。目前通过富集质膜的方法结合质谱及数据库搜寻得到的多为一些丰度较高的蛋白质,细胞表面糖基化蛋白这样的低丰度蛋白则较少得到可靠鉴定。因此,从复杂的生物样品体系中富集糖蛋白／糖肽是蛋白质糖基化研究的重点和难点。本文中,运用细胞表面蛋白捕获技术(Cell Surface Capturing, CSC-technology)对神经干细胞表面糖蛋白进行富集和鉴定。利用此方法共鉴定到了非冗余糖肽有188条,对应于99个糖基化修饰蛋白质及200个糖基化位点,其中有70%的糖基化位点,包括Neural cell adhesion molecule L1、Eph receptor、Neuropilin-1等等一些与神经干细胞增殖分化及神经疾病修复密切相关蛋白质的糖基化位点,为本实验鉴定确认的新的糖基化位点。很多低丰度的受体蛋白及CD分子蛋白如Interleukin-6 receptor, Lysophosphatidic acid receptor 4, CD276, CD98等等均得到鉴定。本工作首次构建C17.2神经干细胞的膜糖蛋白数据,得到了许多与神经干细胞增殖与分化以及退行性疾病修复相关的蛋白质,细胞表面糖蛋白的鉴定对于神经干细胞在这些方向的研究提供了重要信息；鉴定到了26个CD分子,有助于发现新的神经干细胞表面标志物；并且,在这99个糖蛋白中,仅有28个蛋白质与利用双水相方法提取质膜所得的222个质膜蛋白相匹配,因此进一步补充了神经干细胞质膜蛋白质数据。