收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

念珠菌与新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

游亚兰  
【摘要】:目的旨在建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测体系,以实现快速、准确、特异、定量地检测包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌以及新型隐球菌在内的临床侵袭性真菌感染常见的病原菌,为临床医生对该疾病的诊断、治疗提供指导。 方法于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买真菌标准株,培养后制成浓度约为107CFU/ml真菌标准株混悬液,10倍梯度稀释成107~100CFU/ml,用于真菌实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测体系的建立。在基因库(NCBI)中分别下载多种真菌、细菌、病毒以及人类基因序列,通过比对找出五种真菌:白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和新型隐球菌各自的特异性区域,利用Primer Premier5.0和Beacon Designer7.7设计引物探针。通过对比一步裂解法、Lyticase酶消化法、玻璃珠破壁法、Biospin膜吸附法、磁珠法、浓缩裂解法、浓缩裂解结合加热等方法提取真菌DNA的效率及扩增效果,寻找真菌DNA提取的最佳方法。同时通过对Mg~(2+)、dNTP、引物及探针浓度等参数进行优化,筛选出各自的最佳反应体系,并验证反应体系的特异性、重复性,并分析各自反应的灵敏度,对临床分离出的86例真菌病原菌进行检测。 结果成功设计白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和新型隐球菌的特异性引物探针,念珠菌及新型隐球菌的DNA提取效率以及荧光定量PCR效果以浓缩裂解结合加热的方法最佳,扩增曲线呈典型“S”形。在最佳反应体系下,五种真菌的PCR反应体系均能分别对各自对应的真菌进行特异性扩增,而与其他真菌、细菌、病毒以及人类基因组之间无交叉反应。每一个反应体系不同底物浓度与Ct值之间成良好的线性关系,R~2均在0.995以上。白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌以及新型隐球菌反应体系检测的灵敏度为5CFU/ml,热带念珠菌灵敏度为50CFU/ml,所有反应体系稳定性、重复性好,批内、批间重复5次实验,所得每一种反应体系Ct值批内、批间的变异系数均小于5%(在0.22%至3.19%之间)。所建立的5种反应体系对临床分离菌株检测的结果阳性率为100%,并且无交叉反应发生。 结论浓缩裂解结合加热法是适用于实时荧光定量PCR的成功、高效的真菌DNA提取方法。成功设计了特异性检测白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌和新型隐球菌的引物探针,并建立了实时荧光定量PCR检测体系。临床常见的五种致病真菌病原菌全部检出,实验建立的PCR检测体系结果可靠,拥有广泛作为临床侵袭性真菌感染诊断有效手段的巨大潜能。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前19条
1 姚虹;吕治;阎东辉;;实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法及其临床应用[J];中国医刊;2013年11期
2 白颉;李孝军;王泽;吕沁风;;贝类中诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J];中国卫生检验杂志;2016年16期
3 郭强;王英;侯强;张丽娟;顾军;;实时荧光定量PCR检测白念珠菌的可靠性评价[J];中国麻风皮肤病杂志;2009年06期
4 姚虹;吕治;苏建荣;阎东辉;;实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法及价值[J];现代中西医结合杂志;2013年07期
5 苏娇;王艳杰;智达夫;关平原;;鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立[J];畜牧与饲料科学;2013年05期
6 高露娟;余进;李若瑜;;实时荧光定量PCR在侵袭性曲霉病诊断中的研究进展[J];中国真菌学杂志;2012年01期
7 朱德斌;邢晓波;;实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆[J];激光生物学报;2012年03期
8 唐泰山;邓碧华;王凯民;张常印;雷治海;;牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];动物医学进展;2009年04期
9 陈丽;李红海;鲁勇;李向阳;杨锦红;;实时荧光定量PCR检测阴道加德纳菌的方法与应用[J];浙江中西医结合杂志;2009年05期
10 刘文哲;牛明月;李秀云;林二培;黄华宏;童再康;;光皮桦实时荧光定量PCR内参基因的筛选[J];林业科学;2016年08期
11 龙燕;郑磊;曾方银;王前;;光滑假丝酵母菌感染实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];感染、炎症、修复;2012年02期
12 吴捷;王少玲;马焱;曾祥洁;贾鹏本;吴维学;苏新元;李沅;张丽娟;;斑点热群立克次体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J];现代预防医学;2015年22期
13 黄雪玲;冯浩;康振生;;小麦条锈菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择[J];农业生物技术学报;2012年02期
14 王素华;王忠才;李孝军;杜爱芳;;牛副结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];中国畜牧兽医;2012年10期
15 陈刚;邵彪;许蓓蓓;季葛振;;副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立[J];肉类研究;2012年12期
16 黄以宁;廖灿;涂新枝;杨昕;易翠兴;黎丽仙;;应用实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征(英文)[J];中华医学遗传学杂志;2005年06期
17 廖灿,黄以宁,杨昕,涂新枝,易翠兴,潘敏;实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征[J];现代临床医学生物工程学杂志;2004年04期
18 李红妩;李桂军;杨戎威;;实时荧光定量PCR与1,3-β-D葡聚糖试验在儿童肺部真菌感染中的诊断意义[J];中国妇幼保健;2017年03期
19 王宗润;张力文;王宗美;张云峰;;实时荧光定量PCR法检测人粪便中艰难梭状芽孢杆菌[J];中国卫生检验杂志;2015年03期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 祝秀梅;马全英;王凡;吕志慧;杜平;刘学荣;牟克斌;;猪繁殖与呼吸综合征病毒基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 葛忠源;程安春;汪铭书;杨晓燕;齐雪峰;黄永成;张素辉;胡骑;陈孝跃;;乳酸杆菌属16SrDNA实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用研究[A];第三届第八次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集[C];2006年
3 张菲;张兵;钟礼立;谢志萍;高寒春;肖霓光;曾赛珍;赵辛;彭力;丁小芳;林琳;熊洁;彭颖;王娟;段招军;;多重实时荧光定量PCR检测人博卡病毒的价值[A];中华医学会第十七次全国儿科学术大会论文汇编(上册)[C];2012年
4 张淑坤;卢德宏;朴月善;蔡彦宁;徐庆中;;实时荧光定量PCR微卫星分析技术检测少突胶质细胞肿瘤染色体1p/19q杂合性缺失[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
5 乔昀;赵英妹;仲俊;张珏;龚捷文;;实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用[A];第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2014年
6 赵敏;李智;于永春;朱敏;杨建伟;;实时荧光定量PCR检测尿液中的大肠埃希菌[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
7 赵洪喜;刘军龙;李有全;杨聪山;赵帅阳;刘娟;刘爱红;谢俊仁;田占成;刘志杰;刘光远;殷宏;关贵全;罗建勋;;环形泰勒虫转化宿主细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选[A];中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2015年
8 陆飞;鲁会军;李国江;刘昊;刘振江;刘燕瑜;靖杰;任静强;金宁一;;基因Ⅲ型乙型脑炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年
9 肖晓光;;应用实时荧光PCR方法检测乙肝病毒1896位点变异及临床意义[A];2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会论文集[C];2012年
10 谢志勤;谢芝勋;雷剑明;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢丽基;蓝如束;;结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(下册)[C];2009年
11 闫若潜;赵明军;张志凌;张健;盛敏;刘光辉;吴志明;;猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
12 李金明;熊德琴;斯志娟;;实时荧光定量PCR在手足口病检测中的应用[A];第二届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学三江论坛论文汇编[C];2011年
13 顾军;王英;刘维达;沈永年;吕桂霞;陈伟;赵敬军;;用PCR法快速检测播散性念珠菌病兔模型血中的念珠菌[A];2001年中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2001年
14 陈涛;张善磊;张亚东;朱镇;赵庆勇;赵凌;周丽慧;姚姝;赵春芳;王才林;;水稻抗咪唑啉酮类除草剂基因PCR分子标记的开发[A];江苏省遗传学会2016年学术年会论文摘要集[C];2016年
15 茅华华;陈昆慈;赵建;罗青;徐红艳;;斑鳢实时定量PCR内参基因的分离鉴定[A];2016年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2016年
16 刘军龙;李有全;刘爱红;关贵全;谢俊仁;殷宏;罗建勋;;牛环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫多重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2015年
17 王文涛;付雪;岳东梅;宿欣;常巧呈;张艳;王春仁;;牛贝氏贝诺孢子虫巢式PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会论文集[C];2015年
18 杨凡;刘小琬;李萍;方和俊;郭博;刘鹏娟;卓秀萍;徐志文;朱玲;;基于猪传染性胃肠炎病毒S基因纳米粒子PCR方法的建立[A];中国猪业科技大会暨中国畜牧兽医学会2015年学术年会论文集[C];2015年
19 王好玉;管乐东;杨永丽;;PCR方法联合酶联免疫吸附试验检测肺炎支原体感染的临床研究[A];中国中药杂志2015/专集:基层医疗机构从业人员科技论文写作培训会议论文集[C];2016年
20 迟文娟;刘文钰;郭晓帆;张崇;曹远银;;小麦赤霉病病原菌PCR检测方法的研究[A];第十三届沈阳科学学术年会论文集(理工农医)[C];2016年
中国博士学位论文全文数据库 前20条
1 刘志勇;流行性乙型脑炎PCR检测病毒和中医证候特征研究[D];湖北中医药大学;2013年
2 安榆林;光肩星天牛分子遗传多样性及PCR鉴定技术的研究[D];南京林业大学;2004年
3 刘芳;应用多重巢式PCR方法检测急性淋巴细胞白血病相关融合基因及其临床特点分析[D];中国人民解放军医学院;2013年
4 龙飞;基于活菌内标的单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR方法的建立[D];华中农业大学;2008年
5 杨燕丽;实时定量PCR法研究嗜铬细胞瘤的基因表达[D];中国协和医科大学;2008年
6 马孟根;猪源致病性沙门氏菌耐药基因PCR和基因芯片检测技术研究[D];四川大学;2005年
7 任君安;羊肉及其制品中掺假动物源性成分数字PCR技术精准定量研究[D];中国农业大学;2017年
8 黄东益;旗草内生真菌的特异PCR分析与抗菌作用的研究[D];华南热带农业大学;2003年
9 王胜坤;桉树青枯菌菌株致病力分化、吸附识别及PCR快速检测研究[D];中国林业科学研究院;2007年
10 朱鹏宇;基于数字PCR的转基因成分与重金属离子新型检测技术的开发与应用[D];中国农业大学;2016年
11 祁恒;高聚物基连续流式PCR微流控芯片系统与应用技术研究[D];北京工业大学;2009年
12 陈永芳;我国植物青枯菌的遗传多样性和马铃薯青枯菌的PCR检测技术研究[D];中国农业科学院;2000年
13 朱峰;应用基于PCR的改良消减杂交技术克隆凋亡相关基因[D];第四军医大学;1999年
14 贺晨;多重PCR结合基因芯片技术检测国境口岸蜚蠊携带病原菌的应用研究[D];吉林大学;2011年
15 张晓科;中国小麦矮秆基因和春化基因分布及小麦品质相关性状多重PCR体系建立[D];中国农业科学院;2007年
16 祝儒刚;海产品中致病性副溶血弧菌PCR快速检测体系建立及定量研究[D];沈阳农业大学;2011年
17 战晓微;食源性病原菌耐药性多重PCR检测及其溯源研究[D];沈阳农业大学;2014年
18 杨艳秋;多重PCR及微卫星标记技术用于深部病原真菌感染的快速诊断[D];吉林大学;2007年
19 张岩;多引物PCR检测供体角膜疱疹病毒及角膜移植术后病毒传播途径的研究[D];吉林大学;2007年
20 鲜思美;水禽重要疫病的多重PCR与基因芯片检测技术研究[D];四川农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 游亚兰;念珠菌与新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系的建立[D];南华大学;2013年
2 赵鑫;鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D];山西农业大学;2014年
3 沈付娆;牛冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D];山东师范大学;2015年
4 邵惠;条斑紫菜(Pyropia/Porphyra yezoensis)实时荧光定量PCR内参基因的筛选[D];中国海洋大学;2012年
5 常鹏;应用实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织中人乳头状瘤病毒的研究[D];第四军医大学;2010年
6 曾庆贺;布鲁氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立和临床应用的初步研究[D];吉林大学;2014年
7 年四季;小麦矮腥黑穗菌常规PCR与实时荧光定量PCR检验检疫技术研究[D];重庆大学;2007年
8 蔡婧;伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[D];承德医学院;2015年
9 苏娇;鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立[D];内蒙古农业大学;2013年
10 郑文芝;人多瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床研究[D];内蒙古农业大学;2012年
11 杨丽聪;鸡传染性贫血病毒感染宿主后的基因表达谱分析及实时荧光定量PCR检测方法的建立[D];河北农业大学;2015年
12 苏日娜;实时荧光定量PCR检测小鼠肠道乳酸菌及细胞因子含量的研究[D];内蒙古农业大学;2015年
13 王倩;土壤中茄链格孢半巢式和实时荧光定量PCR检测方法的建立[D];河北农业大学;2014年
14 孟茹;布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法与血清快速诊断试纸的初步研究[D];石河子大学;2010年
15 叶晓艳;实时荧光定量PCR检测肠道病毒方法的建立[D];华中科技大学;2009年
16 李明;实时荧光定量PCR技术在侵袭性真菌感染诊断中的价值[D];宁夏医科大学;2016年
17 冉艳;肺炎克雷伯菌荧光定量PCR检测方法的建立和临床应用[D];浙江大学;2015年
18 郭世奎;实时荧光定量PCR技术对结直肠癌患者肠道微生态的研究[D];昆明医学院;2011年
19 任月;应用实时荧光定量PCR方法检测肠球菌的研究[D];大连医科大学;2007年
20 赵立红;实时荧光定量PCR检测临床标本中淋病奈瑟菌[D];青岛大学;2002年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 金玉静 民生期货;期权成交PCR骤降[N];期货日报;2017年
2 许春林 记者 郭盛起;核酸检测先进数字PCR技术在我市投入使用[N];伊春日报;2021年
3 记者 陈海波;数字PCR法可实现对新冠病毒核酸高精确测量[N];光明日报;2021年
4 记者 马承璐 李亚锋;州新冠病毒检测PCR实验室建成并投入使用[N];伊犁日报(汉);2020年
5 郑璐 袁泉;晋城市核酸检测基地PCR方舱实验室投入使用[N];山西日报;2021年
6 申银万国期货 吴广奇;期权PCR指标的逻辑解析及择时应用[N];期货日报;2020年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978