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MiR-467b靶向调控小鼠巨噬细胞LPL对动脉粥样硬化的影响

田国平  
【摘要】:动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)引起的心脑血管疾病严重危害人类健康,其发病率正逐年上升,已成为当前亟待解决的首要健康问题之一。As的发病是一个多因素参与的复杂病理过程,其中巨噬细胞胆固醇过量蓄积和血管壁炎症反应是其核心环节。因此,减少巨噬细胞内胆固醇蓄积和抑制血管壁炎症反应对As的防治具有重要意义。 MiRNAs是一类内生性单链成熟非编码RNA,长约22个核苷酸,主要通过形成RNA诱导沉默复合体(RNAinduced silencing complex, RISC)与靶标mRNA的3’UTR发生不完全配对,诱导mRNA切割降解或翻译抑制。新近研究发现,miR-467b在多酚类物质处理的apoE-/-鼠中表达上调,提示miR-467b在动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用,但miR-467b在动脉粥样硬化中的相关机制还不清楚。 为了探讨miR-467b对动脉粥样硬化的相关作用机制,我们利用生物信息学来评估miR-467b的靶标基因,发现miR-467b恰具有靶向调控脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)的生物学基础。基于我们团队的研究工作和文献归纳整理,发现血管壁细胞尤其是巨噬细胞中的LPL具有促进泡沫细胞形成、炎症因子表达及粘附分子上调的作用,其在apoE基因缺陷小鼠动脉高表达,引起脂质沉积以及黏附因子高表达,进而导致As的发生发展。因此,miR-467b可能靶向沉默巨噬细胞内的LPL,影响脂质蓄积和炎症因子分泌,抑制As的发生发展。 第一部分miR-467b靶标基因的预测及与巨噬细胞LPL3’UTR的靶向作用 目的:预测miR-467b的靶标基因,观察miR-467b是否与LPL靶向结合及结合的位点和自由能情况。 方法:从miRNAbase数据库获取成熟的miR-467b序列,从GeneBank下载获得LPL基因的3’UTR。利用EMBL-EBI和RNAhybrid在线软件观察小鼠miR-467b与小鼠LPL的结合情况。根据预测结果,培养小鼠RAW264.7巨噬细胞株,采用PCR方法扩增小鼠RAW264.7细胞LPL的3’UTR,将其构建到PGL-3载体上,利用脂质体2000转染试剂,将miR-467b mimics或miR-467b inhibitor与PGL-3-LPL3’UTR分别共转染到HEK293T细胞中,观察荧光素酶报告基因的活性和LPL蛋白表达。 结果:成功应用生物信息学手段对小鼠miR-467b的成熟序列和LPL的3’UTR序列进行了分析,获得了大量的数据;经过初步的预测和分析,miR-467b在LPL的3’UTR中存在靶结合位点,且结合得分较高,结合自由能较低。共转染miR-467b mimics和带有LPL3’ UTR的荧光素酶报告基因结合,能使荧光素酶活性和蛋白减弱,而共转染miR-467b inhibitor,能使荧光素酶活性和蛋白增强,为下一步的实验研究提供了可靠的理论基础。 结论:miR-467b具有靶向沉默小鼠LPL的生物信息学基础,能够靶向结合小鼠巨噬细胞LPL3’UTR。 第二部分miR-467b靶向沉默小鼠RAW264.7巨噬细胞 LPL表达对脂质蓄积和炎症因子表达的影响 目的:观察对miR-467b对内源性LPLmRNA和蛋白及其引发的脂质蓄积和炎症因子分泌的影响。 方法:培养小鼠RAW264.7巨噬细胞株,利用脂质体2000转染试剂,将miR-467b mimics或miR-467b inhibitor转染到RAW264.7细胞中,实时荧光定量PCR和Western-blot检测LPL mRNA和蛋白表达;HPLC检测细胞内的脂质蓄积情况;Dil-ox-LDL法检测细胞脂质摄取情况;ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌情况。 结果:转染miR-467b mimics能够明显减少小鼠RAW264.7巨噬细胞LPLmRNA和蛋白表达、细胞脂质摄取和细胞内脂质蓄积、IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌,而转染miR-467b inhibitor则明显增加小鼠RAW264.7巨噬细胞LPL mRNA和蛋白表达、细胞脂质摄取和细胞内脂质蓄积、IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌。 结论: (1)miR-467b靶向沉默小鼠RAW264.7巨噬细胞LPL mRNA和蛋白表达。 (2)miR-467b减少小鼠RAW264.7巨噬细胞脂质蓄积,抑制炎症因子分泌,其机制可能与靶向调控LPL有关。 第三部分miR-467b对apoE-/-鼠血管壁脂质蓄积、炎症反应和As病变的影响 目的:观察miR-467b对apoE-/-小鼠血管壁脂质蓄积、炎症反应及动脉粥样硬化病变的影响及机制。 方法:采用高脂高胆固醇饮食饲喂apoE敲除小鼠,并随机分为4组:miR-467b agomir negative control(AG-NC)组、miR-467b agomir(AG)组、miR-467b antagomir negative control(AN-NC)组、miR-467b antagomir(AN)组,采用酶氧化法检测甘油三酯、总胆固醇等血脂水平;ELISA法检测血清炎症细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1)的表达;HE染色法观察主动脉窦动脉粥样硬化病变情况;油红O染色观察主动脉和主动脉窦处脂质蓄积情况;荧光定量PCR和Western blotting免疫印迹法检测小鼠主动脉LPL mRNA和蛋白表达;提取小鼠腹腔巨噬细胞,检测LPL mRNA和蛋白表达情况,HPLC检测小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平。 结果:转染miR-467b agomir能够明显减少小鼠腹腔巨噬细胞LPL mRNA和蛋白表达、腹腔巨噬细胞内的脂质蓄积和脂质摄取、血脂水平,血浆中的IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌、主动脉窦动脉粥样硬化病变、主动脉和主动脉窦处脂质蓄积,而转染miR-467b antagomir则明显增加小鼠腹腔巨噬细胞LPLmRNA和蛋白表达、腹腔巨噬细胞内的脂质蓄积、血脂水平,血浆中的IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌、主动脉窦动脉粥样硬化病变、主动脉和主动脉窦处脂质蓄积。 结论:(1)miR-467b减少apoE敲除小鼠斑块内脂质蓄积、炎症因子表达抑制病变发展。(2)miR-467b的抗动脉粥样硬化效应可能与靶向沉默apoE敲除小鼠巨噬细胞LPL有关。


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