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抑制Beclin1促进TOCP诱导人成神经瘤SH-SY5Y细胞产生凋亡

魏传杰  
【摘要】:目的 探讨自噬与凋亡在三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)诱发SH-SY5Y细胞神经毒性中的关系,进一步阐述TOCP神经毒性的作用机制。 方法 1.采用RNAi技术,构建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体;将重组质粒转染SH-SY5Y细胞,G418筛选出Beclin1稳定低表达的SH-SY5Y细胞系(sh-Beclin1细胞系),RT-PCR与Western blot检测sh-Beclin1细胞系Beclin1基因的mRNA与蛋白表达。 2.不同浓度TOCP(0,0.5mM)分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h,MDC染色观察两组细胞系自噬泡的数量变化,Western blot检测两组细胞中LC3-II蛋白的表达。 3.不同浓度TOCP(0,0.25,0.5,1.0mM)分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h,Hoechst33258染色观察两组细胞系细胞核形态,流式细胞仪检测两组细胞系细胞周期的变化,Western blot检测两组细胞系凋亡相关基因Bax,Bcl-2,Caspase-3蛋白的表达。 结果 1.测序证实pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体构建成功。荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot技术鉴定Beclin1基因稳定敲减SH-SY5Y细胞系建立成功。 2.MDC染色结果和Western blot结果显示,与对照组SH-SY5Y细胞比较,TOCP (0.5mmol/L)处理sh-Beclin1细胞系48h后,产生自噬泡的数量明显减少,LC3-II蛋白表达明显降低。 3.与对照组SH-SY5Y细胞比较,sh-Beclin1细胞经不同浓度TOCP(0,1.0mM)处理48h后进行Hoechst33258染色,在荧光显微镜下可见细胞核蓝色荧光增强,染色质聚集明显,且有部分细胞出现细胞核碎裂、溶解,细胞出现典型的凋亡现象,且产生核碎裂的细胞数量随TOCP浓度升高而增加。 4.不同浓度的TOCP(0,0.25,0.5,1.0mM)处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后,流式细胞仪检测细胞周期结果显示:与对照组SH-SY5Y细胞比较,sh-Beclin1细胞G1期前有亚二倍体凋亡峰的出现,并凋亡细胞数量随着TOCP浓度增高而增多,并呈现剂量-效应关系(P0.05)。 5.不同浓度的TOCP(0,0.25,0.5,1.0mM)处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后,Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示:在SH-SY5Y细胞中,凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值无升高或降低趋势,Cleaved-caspase-3蛋白表达无显著变化,在sh-Beclin1细胞中,凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值呈降低,并呈剂量-效应关系(P0.05),cleaved-caspase-3蛋白表达无显著变化。 结论 1.干扰Beclin1基因的表达可抑制TOCP诱导的SH-SY5Y细胞产生自噬,Beclin1蛋白在TOCP诱导的自噬中起重要的作用。 2.TOCP诱发Beclin1基因敲减SH-SY5Y细胞系产生线粒体介导的非Caspase-3依赖的凋亡。


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