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LncRNA HOTAIR作为miR-130b的ceRNA调控PTEN/AKT信号通路影响髓核细胞增殖

陈文康  
【摘要】:第一部分人退变髓核细胞的分离及培养目的:本研究应用酶消化法分离和培养人退变的NP细胞,为探讨IDD发病机制的研究奠定实验基础。方法:利用胰酶和II型胶原(Col II)联合消化法对IDD患者的椎间盘手术标本进行NP组织分离并培养NP细胞,传代,观察细胞形态。取第2代退变NP细胞,进行免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色以鉴定。结果:免疫细胞化学染色、甲苯胺蓝染色鉴定培养的细胞为NP细胞,并顺利传代。结论:1.应用酶消化法成功培养出NP细胞;2.P2代NP细胞可用于体外实验。第二部分lnc RNA HOTAIR作为miR-130b的ce RNA调控PTEN/AKT信号通路影响髓核细胞增殖目的:当前,越来越多的临床疾病的发病机制随着于高通量测序及基因芯片技术的发展得到了进一步的阐明。当前,已有基因芯片检测得出HOTAIR在退变性椎间盘疾病中显著差异表达,为了进一步明确其是否参与了IDD发生、发展过程,本部分实验具体探讨了HOTAIR在细胞增殖中作用的具体机制。方法:利用q RT-PCR技术对50例病人椎间盘髓核组织(8例正常的髓核组织和42例退变的髓核组织)标本验证HOTAIR在退变的组织中显著低表达,并对不同Pfirrmann分级的髓核标本进行q RT-PCR分析验证。然后利用q RT-PCR、Western blot、ki-67免疫荧光染色检测了HOTAIR与细胞增殖的关系;生物信息学网站预测得出HOTAIR与PTEN均与miR-130b有结合靶点,双荧光素酶基因检测确认靶点的存在,同时利用q RT-PCR技术对在上诉50例不同退变程度的髓核组织标本验证miR-130b在退变的组织中显著低表达且与HOTAIR表达程负相关,相反与退变程度程正相关,进一步利用Western blot、ki-67免疫荧光染色在蛋白水平验证了HOTAIR能够靶向miR-130b从而影响PTEN表达,激活或抑制PI3K/AKT通路对细胞增殖产生作用。结果:(1)在人退变的NP组织中HOTAIR呈显著低表达,并与椎间盘退变等级呈负相关,揭示椎间盘退变的病理进程可能与HOTAIR表达异常相关。(2)HOTAIR能靶向抑制人退变NP细胞中细胞增殖相关蛋白的表达水平;(3)HOTAIR作为ce RNA降低miR-130b对PTEN表达的抑制,从而抑制AKT信号通路来诱导人退变NP细胞的增殖。结论:HOTAIR能作为ce RNA降低miR-130b对PTEN表达的抑制,从而抑制AKT信号通路来诱导人退变NP细胞的增殖。


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