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肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌的碳青霉烯类抗生素耐药机制研究

黄雪龙  
【摘要】:背景:抗生素的发现和使用提高了临床抗感染的治疗效果,为人类的健康事业做出了重要的贡献,超范围、超剂量抗生素的使用,导致了细菌耐药性的产生,给细菌感染性疾病治疗带来了极大困难,细菌在抗生素压力环境下通过基因突变,基因重组,获取外源质粒等方式导致了细菌产生耐药,碳青霉烯类抗生素耐药机制得到关注,研究人员发现碳青霉烯类抗生素耐药机制主要有:细菌细胞膜通透性的改变、质粒转导、主动外排泵系统、碳青霉烯酶的产生,以及整合子介导耐药性改变等。细菌染色体上的耐药基因可以在移动原件的作用下整合到细菌的质粒上,这一生物学现象可以导致耐药基因的大面积扩散;质粒可以通过细菌的性菌毛接触而传递遗传物质。因此,明确细菌基因组中的耐药基因、质粒、移动原件、插入序列、转座子,以及耐药基因传播扩散的分子机制非常重要。目的:本论文在课题组研究基础上探讨肠杆菌科中肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌的耐碳青霉烯类抗生素机制,将对临床合理使用抗生素、避免细菌产生耐药性等均具有重要的意义。方法:1.收集不同来源临床分离株,对其进行药敏实验,分离耐药菌株。2.应用微量肉汤稀释法测定耐药株对临床常用抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。3.对耐碳青霉烯类抗生素的菌株进行Carba NP法确定该菌株是否产碳青霉烯酶以及所产酶所属的类型。4.利用基因组高通量测序法以及PCR检测方法,研究分离的耐药菌株所携带的耐药基因,如超广谱β-内酰胺酶耐药基因、喹诺酮耐药基因、四环素耐药基因和氨基糖苷类耐药基因等。5.通过质粒接合转导实验确定耐药基因的水平转移性。6.细菌主动外排系统中的外排泵介导细菌耐药的分子机制。7.应用细菌二代全基因组测序确认耐药基因在全基因组中所处的位置。结果:1.筛选得到的肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌对碳青霉烯类抗生素典型药物,亚胺培南和美罗培南比阿培南的MIC值均大于10μg/mL。2.通过二代基因组测序结合PCR扩增实验,肺炎克雷伯菌检测到IMP-4,DHA-1,qnrs1和TetA等耐药基因。3.质粒提取结果表明,肺炎克雷伯菌具有质粒,该质粒可以通过大肠杆菌接合转导实验,介导宿主菌碳青霉烯类抗生素耐药。4.肺炎克雷伯菌质粒二代测序结果表明,肺炎克雷伯菌质粒结构包括IncN1型的保守骨架区以及repA以及tra等基因。在质粒的骨架区整合了许多的外源插入序列,耐药基因大多包含在插入序列中。结论:1.肺炎克雷伯菌通过表达碳青霉烯酶类酶IMP-4和DHA-1,水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺环,从而对碳青霉烯类抗生素产生耐药。2.质粒接合转导实验证明碳青霉烯酶类耐药基因可以通过质粒水平转移,警示我们注意抗生素耐药基因扩散风险。3.利用二代全基因组测序扫描技术,明确了耐药质粒的基本结构,分析了质粒复制起始基因,质粒骨架区以及质粒外源插入区,确定了质粒耐药基因在细菌基因组中的位置和移动原件的作用方式,从而初步阐明了由质粒介导的多重耐药基因传播扩散的机制,为多重耐药菌乃至泛耐药菌的耐药基因传播机制提供了理论基础。


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