miR-19a靶向调控SOCS3激活JAK1-STAT3通路对非小细胞肺癌生物学特性的影响

【摘要】：目的:探究mi R-19a靶向调节SOCS3(Suppressors Of Cytokines Signaling3细胞因子信号转导抑制蛋白3)激活JAK1-STAT3(Janus Kinase1-Signaling Transducers And Activators Transcription3 Janus激酶信号转导与转录激活因子3)信号通路对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学特性影响。方法及材料:选用南华大学附属第二医院胸外科2019年1月至2019年6月外科手术切除的原发性非小细胞肺癌组织30例,并配对同一部位肺癌旁正常肺组织(距离病灶5cm,经病理切片及免疫组化证实无肿瘤细胞浸润)作对照,所取标本均由病理学证实为NSCLC。培养人非小细胞肺癌A549细胞株,取对数生长期细胞进行转染。根据转染物不同对试验细胞进行分组:H-mi R-19a组(mimic-mi RNA19a转染的A549细胞);L-mi R-19a组(inhibitor-mi RNA19a转染A549细胞);p-SOCS3组(L-mi R-19a组A549细胞进行SOCS3激动剂处理);Control组。细胞转染结束后,再次进行培养,时间为48h。通过q RtPCR检测NSCLC组织及癌旁组中的mi R-19a、SOCS3的表达,探究mi R-19a和SOCS3与肺癌临床分期、肿瘤理分类及有无远处转移等临床特征的相关性。体外研究分析:通过q Rt-PCR检测各组细胞中的mi R-19a和SOCS3的表达确认转染的成功性;应用Western-blot(蛋白印迹试验)检测SOCS3、JAK1-STAT3、Bcl-2\Bax蛋白表达浓度。下一步应用MTT(四甲基鸟氮唑蓝)比色法检测各组细胞存活和生长情况;Annexin-V/PI(流式细胞仪)检测各组细胞的凋亡率,通过划痕及Transwell实验分析各组细胞迁移、侵袭状况,结果:(1)q Rt-PCR检测肺癌组织与肺癌旁正常肺组织中mi R19a和SOCS3比较,非小细胞肺癌组织中mi R-19a表达更高,两组数据比较p0.05差异具有统计学意义。而癌旁正常肺组织中SOCS3表达更高,两组数据比较p0.05差异具有统计学意义。(2)临床特点分析:SOCS3、mi R-19a的表达在有无淋巴结转移、病理类型、临床TNM分期等方面差异明显,两组数据比较p0.05,具有统计学意义;SOCS3、mi R-19a的表达在有无吸烟史、性别、年龄等方面差异无统计学意义(p0.05)。(3)通过q Rt-PCR检测体外转染细胞中的mi R-19a和SOCS3的表达,mi R-19a的表达H-mi R-19a组Control组L-mi R-19a组pSOCS3组;而SOCS3与其相反;两两比较p0.05,差异有统计学意义。与临床组织检测结果呈现出一致性,验证了细胞mi19a质粒转染的成功性,为下一步的研究做好了铺垫。(4)WB检测:JAK1及STAT3蛋白在A549细胞中具有一致性蛋白浓度,其中H-mi R-19a最高,其次为Control、L-mi R-19a,最低为p-SOCS3,两两比较p0.05。SOCS3蛋白浓度在p-SOCS3水平最高,其次为L-mi R-19a、Control,最低为H-mi R-19a,两两比较p0.05差异具有统计学意义。Bcl-1蛋白的表达与JAK1-STAT3表达趋势一致。Bax蛋白表达相反。(5)MTT检测细胞的存活和生长状态,48h,H-mi R-19a组在OD570nm波长处的吸光值明显高于p-SOCS3组,其次为对照组和inhibitor处理组,两两比较p0.05,差异具有统计学意义。(6)Annexin-V/PI法测定非小细胞肺癌细胞凋亡率。各组细胞凋亡率:H-mi R-19a组最低,其次为Control、L-mi R-19a,最高为pSOCS3组。两两比较p0.05,差异具有统计学意义。(7)Transwell和划痕实验结果显示,在12h和24h,p SOCS3组Transwell下室侵袭的A549细胞数最少,划痕试验的划痕愈合最慢,其次为L-mi R-19a。Transwell下室侵袭细胞数,划痕试验的划痕愈合速度H-mi R-19a大于Control组。H-mi R19组为下室侵袭细胞数最多、划痕愈合速度最快组,数据比较p0.05,差异有统计学意义。结论:(1)淋巴结转移、肿瘤病理类型、临床TNM分期是影响非小细胞肺癌组织中mi R-19a,SOCS3表达的重要因素。(2)miR-19a在人非小细胞肺癌中靶向调控SOCS3激活JAK1-STAT3通路中JAK1、STAT3蛋白表达,从而降低细胞凋亡,促进细胞的增殖、迁移和侵袭。