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早期骨关节炎软骨下骨基因表达谱的实验研究

张荣凯  
【摘要】:骨性关节炎(OA)是一种退变性关节疾病,涉及关节的所有组织,在病变过程中可观察到关节软骨、滑膜、软骨下骨及周围软组织(肌肉、韧带等)的结构改变,表现为关节软骨失常,传导应力负荷失常,导致软骨的生物力学及生物化学环境发生改变,逐渐发生软骨的降解质变,最终发生软骨变薄、纤维化、糜烂、裂隙、肉眼下溃疡及全层关节面消失等。以往对OA的病因研究多集中于关节软骨的破坏,越来越多的研究表明,软骨下骨改变在OA发病过程中起着积极作用,即软骨下骨硬化与OA的发生、发展密切相关,不只是OA发生的结果,而且,软骨下骨的改变有可能先于关节软骨的改变。 关节软骨下骨包括皮质终板以及紧靠其下方的骨小梁、血管和小梁间的腔隙。软骨下骨的基本功能为吸收应力、缓冲震荡和维持关节的形状。在OA病例中,软骨下骨常出现硬化、囊性化、无菌性坏死等改变。有研究表明软骨下骨改变可引发关节软骨破坏及进行性恶化,软骨下骨硬化可导致软骨细胞功能失调及OA发生。基因芯片是将大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载体上,再将样品用荧光染料标记制备成探针,与芯片进行分子杂交反应,检测杂交信号强度,并经计算机分析和数据处理,从而对基因序列和功能进行大规模、高速度、高通量的研究。已有学者将基因芯片用于骨关节炎的研究,报道了利用基因芯片研究OA软骨或骨组织的基因表达谱,发现了一系列与骨关节炎发病密切相关的差异表达基因与信号通路,并以基因表达变化入手探讨骨关节炎的发病机制。然而,目前尚无利用基因芯片研究与软骨紧密相连的软骨下骨的基因差异表达的文献报告。其原因可能主要是获取合适的早期OA的人软骨下骨标本十分困难,而研究晚期OA的软骨下骨标本硬化、囊性变等改变导致难以推断其早期的分子机制。但软骨下骨的异常改变和关节软骨的退变之间有着十分密切的联系,与关节软骨紧密相邻的软骨下骨,其与软骨的相互作用可能也越密切。研究早期OA的软骨下骨改变对于OA的早期诊断、早期治疗有着重大意义。 在本研究中,我们利用手术切除SD大鼠膝关节“内侧半月板+内侧副韧带”造成膝关节不稳而导致的膝关节骨关节炎模型,用基因芯片技术对大鼠膝关节骨关节炎的软骨下骨进行了基因表达谱的研究与分析,从基因表达改变入手,进一步以免疫组化技术从蛋白水平全面研究膝关节早期骨关节炎动物模型的关节软骨下骨的变化,进一步阐述人类OA相关的分子机制,为早期诊治OA提供重要依据,利于对OA进行早期诊断、早期治疗,利于对OA的全面治疗。 一、实验目的 (1)研究以SD大鼠建模的早期骨关节炎软骨下骨的基因表达谱。(2)从基因水平探索早期OA软骨下骨改变的分子机制。(3)筛选与骨关节炎密切相关的软骨下骨差异表达基因和信号通路,探索OA可作为早期干预及治疗的新靶点。 二、实验方法与结果 第一部分大鼠膝关节早期骨关节炎模型的建立方法:选取大小、体重相似的雄性SD大鼠90只,编号后,随机分为两组(实验组、对照组各45只)。实验组大鼠行右膝关节“内侧副韧带切断+内侧半月板切除”造成关节不稳。同样的方法处理对照组老鼠,但不切断内侧副韧带,不切除内侧半月板。术后肌注一次青霉素(4万u/ml)1ml抗感染、曲马多(10mg/kg)止痛。于术后1W、2W、4W分别随机抓取老鼠各30只(实验组、对照组各15只),10只取右膝关节骨组织进行病理检查证实建模情况及用于后继免疫组化实验,另20只分离出膝关节后立即放入液氮保存至分离软骨下骨组织及提取RNA,用于后继实验。 结果:(1)大体观察可见实验组术后1周,关节面无破损;术后2周,软骨表面稍显粗糙;术后4周,软骨面轻度糜烂。对照组关节面正常。(2)组织学观察发现实验组术后1周,软骨表面光滑,表层软骨番红O-固绿染色不均匀、染色稍减退;术后2周,软骨表面见裂隙,细胞数增多,结构稍紊乱,局部软骨细胞片状剥脱,关节面纤维组织覆盖,潮线部分断裂;术后4周,局部软骨细胞脱落消失,钙化层和软骨下骨外露,细胞数目增多,细胞簇集现象明显,潮线模糊断裂。对照组关节软骨正常。 第二部分大鼠软骨下骨的分离及总RNA的提取 方法:液氮保护下使用微动力磨钻打磨分离大鼠膝关节软骨下骨标本,并结合Trizol一步法与硅胶离心柱纯化方法提取软骨下骨总RNA。结果:(1)琼脂糖凝胶电泳显示提出的各样品RNA电泳图中28S及18S条带清晰,比例约为2:1,5S条带亦可见,表明了RNA是完整的。(2)紫外分光光度计测量提取的RNA吸光度值,比值均位于1.8~2.0之间,表明提取的RNA纯度高。 第三部分软骨下骨全基因表达谱的测定及生物信息学分析 方法:30个样品(实验组、对照组各15只),每个标本分别使用1ugRNA,分别经逆转录为cDNA、cy3荧光标记、与Agilent全基因芯片(包含45,018个基因探针)杂交、芯片洗脱、扫描获取探针的荧光信号,最后获得基因芯片的原始数据,使用Agilent GeneSpring GX software (version11.0)软件系统,并对基因芯片原始数据进行预处理和归一化校正处理后,对数据进行差异基因分析、聚类分析、基因功能(GO)分析和差异基因信号通路(Pathway)分析。 结果:(1)差异基因分析结果:术后1周,找到2234个DEG,术后2周,找到1944个DEG,术后4周,找到1517个DEG,其中,术后1周、2周上调与下调的DEG数占各自的DEG总数的比例相似,术后4周下调的DEG数约为上调DEG数的2倍。1W vs2W有659个共同的DEG,2W vs4W有243个共同的DEG,1W vs4W有285个共同的DEG,共同的DEG表达变化趋势具有规律性。将一些已知与骨关节炎有关的DEG进行归类,得到一系列关于破骨细胞、成骨细胞及一些细胞因子的DEG。(2)聚类分析结果:E组与S组在三个时间点,其标本各自归于同一类,提示骨关炎的疾病的不同阶段,软骨下骨在不同的疾病进程中具有不同的分子机制。(3)GO分析结果:涉及生物进程、细胞成份和分子功能三个方面的DEG比例大致相似。术后1W与术后2W的DEG涉及很多共同的生物进程,提示了早期骨关节炎软骨下骨改变具有类似的生物进程。只有骨发育这一生物进程贯穿了三个时间点。从DEG在细胞成份的归类可见术后1W与术后2W的大部分DEG主要涉及细胞外成分,术后4W的DEG在细胞成份的归类主要涉及细胞内成分。术后1W、2W、4W主要的DEG涉及分子功能相同类别极少。(4)Pathway分析结果:术后1周软骨下骨的改变涉及5条重要的代谢通路,分别是细胞因子与其受体相互作用信号通路、细胞外基质受体作用信号通路、胞吞作用信号通路、TGF-β信号通路和趋化因子信号通路。术后2周软骨下骨的改变涉及2条代谢通路,分别是色氨酸代谢信号通路和TGF-β信号通路。术后第4周涉及3条代谢通路,分别是加压素-白氨酸-异亮氨酸合成信号通路、卟啉与叶绿素代谢通路和核糖体信号通路。 第四部分软骨下骨全基因表达谱实验结果的初步验证 方法:根据基因芯片分析结果,挑选与OA软骨下骨代谢关系密切的10个基因,使用30个不同于基因芯片的软骨下骨RNA标本,采用染料法(SYBR Green I)实时荧光定量PCR技术进行相对定量分析,以GAPDH作为内参照基因,定量研究目的基因在软骨下骨的表达情况,同时进一步验证芯片结果。再选取2个重要基因Mmp3与Aspn,用免疫组化技术(Envision二步法)从蛋白水平进一步验证芯片结果。结果:(1)Acp5、Mmp3、Igf1在三个时间点的基因表达变化与芯片结果完全相同;Postn、Aspn、Bmp5、Tgf-β1、Tnfsf11有两个时间点的基因表达变化与芯片结果相同;Ihh、Alp只有一个时间点的基因表达变化与芯片结果相同。(2)在术后1W,2W两个时间点,实验组软骨下骨区可见大量多核细胞和单核呈Mmp3阳性,结果与基因芯片分析及实时荧光定量PCR实验结果相同。Aspn在实验组与对照组均无阳性表达。 三、结论 1、通过切断内侧副韧带及切除内侧半月板,能成功建立与人类OA病理变化相似的SD大鼠膝关节骨性关节炎模型。 2、液氮下微动力磨钻打磨分离膝关节软骨下骨方法能有效避免骨RNA的降解,能确保得高质量RNA用于后继的基因研究,这种方法是软骨下骨基因表达相关研究值得推广的技术。 3、膝关节骨关节炎疾病进程的不同阶段(时间点),软骨下骨改变具有不同的分子机制。 4、在早期骨关节炎,软骨下骨发生了一系列骨代谢的改变,在骨关节炎发病中起了重要作用,软骨下骨可作为治疗的靶点。 5、软骨下骨新发现的差异基因及传导通路,可能与OA发生发展密切相关,在骨关节炎疾病进程起了重要作用,可作为早期干预及治疗的新靶点,值得进一步深入研究。


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