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麻痹性贝类毒素受体蛋白Saxiphilin的表达及其结合活性测定

曹玲  
【摘要】:麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisons,PSPs)是有毒赤潮中的一些有毒藻的天然产物。当贝类摄食这类有毒藻后,PSPs在其体内累积但并不造成伤害;人食入此贝类后,毒素经消化迅速扩散,出现头痛恶心、流涎发烧和皮疹等症状,严重时导致肌肉麻痹,呼吸困难,甚至死亡。麻痹性贝类毒素受体蛋白—Saxiphilin (SAX)是一种可溶性蛋白,广泛分布于节肢动物、鱼类、两栖动物和爬行动物中。 在本研究中,我们从牛蛙肝脏内提取总RNA后,反转录得到saxiphilin(sax)目的基因。利用特异引物克隆得到N端不带信号肽序列但C端带有组氨酸标签的sax-p基因,并克隆到pET-28a原核表达载体后转化到BL21(DE3)表达菌株中,得到能大量表达SAX-p(SAX expressed in prokaryotic expression system)的BL21(DE3)-sax-p菌株。通过优化表达条件,发现在诱导温度为23℃、诱导前菌体OD600值为0.415和IPTG浓度为1mmol/L下,诱导培养9.5h时,SAX-p以包涵体形式大量表达,采用高浓度盐酸胍溶液溶解包涵体使SAX-p溶解释放,再逐步降低盐酸胍浓度,使蛋白在镍柱上缓慢复性,进而洗脱得到纯化的SAX-p。利用特异引物克隆得到N端带有信号肽序列且C端带有组氨酸标签的sax-e基因,并克隆到pEASY-T3载体,然后亚克隆至pFastBac1质粒,得到pFB1-sax-e,将此质粒转化进DH10Bac中,构建出一株超量表达SAX-e(SAX expressed ineukaryotic expression system)的重组病毒vAc-sax-e。感染的Sf9细胞在无血清培养基中培养72h后,收取培养基上清,得到分泌到细胞外的可溶性SAX-e,通过超滤管进行初步浓缩并替换缓冲液,再在镍柱上进行蛋白纯化,得到纯化的SAX-e。 毛细管电泳,又叫高效毛细管电泳,是粒子在电场力的驱动下,在毛细管中按物质淌度或分配行为的差异进行高效分离的一种电泳技术,被广泛应用于物质间的相互作用的研究。本研究采用该技术对SAX-e与PSPs的结合能力进行测定。首先对毛细管电泳中进样时间和分离电压进行摸索,得到最佳电泳条件为进样20sec和分离电压15kv,在此条件下对石房蛤毒素(saxitoxin,STX)、脱氨甲酰基石房蛤毒素(decarbamoyl saxitoxin,dcSTX)和新石房蛤毒素(neosaxitoxin,neoSTX)进行电泳分离。再以不同浓度的SAX-e溶液为运行缓冲液,以毒素为分离样品进行毛细管电泳,探究SAX-e和毒素的结合,分析相应出峰时间得到回归方程,经过计算得出SAX-e与毒素的结合能力大小依次为STX neoSTXdcSTX。 本研究结果表明,利用杆状病毒表达载体系统表达纯化的SAX-e具有PSPs的结合活性,可望用于食品中PSPs毒素的检测。


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