弓形虫侵入相关分子ROP1基因的克隆及其DNA免疫研究

【摘要】：研究目的 体外扩增弓形虫4个不同分离株侵入相关分子ROP1基因；构建原核及真核表达重组质粒并表达；用DNA免疫技术将真核重组质粒pcROP1直接免疫小鼠，以了解ROP1基因的遗传稳定性；研究该基因体外表达产物的抗原性；观察其在小鼠肌肉组织中的表达、所诱导的体液和细胞免疫应答、IFN-γ基因的协同免疫作用及对弓形虫感染的保护性；探索弓形虫DNA免疫新途径，为弓形虫病的免疫预防提供理论及实验依据。 研究内容 包括ROP1基因重组质粒构建及其DNA免疫两部分。方法 ①弓形虫ROP1基因的体外扩增、克隆及表达 从弓形虫RH、ZS1、ZS2及GT1分离株速殖子基因组DNA中扩增ROP1基因片段；构建pUC18-ROP1重组质粒，酶切及PCR鉴定。亚克隆法构建pBV220-ROP1原核表达重组质粒，经温度诱导在E.coli中表达，表达产物经SDS-PAGE及Western-blot分析；亚克隆法构建pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒，脂质体介导法转染肝癌HEPG-2细胞株，用G418选择培养，分别收集阳性细胞克隆培养上清及细胞，SDS-PAGE及Western-blot鉴定；构建pcDNA3-IFN-γ重组质粒。②pcROP1质粒