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耐热糖苷水解酶57家族基因的克隆表达及功能鉴定

王慧  
【摘要】:占地球表面积约71%的海洋中微生物资源非常丰富,是多种活性物质和工业上有重要应用价值的酶基因的天然宝库。由于环境的极端性及特殊性,超过95%的海洋微生物在现有实验条件下不能被培养,这成为海洋微生物资源开发利用的瓶颈。利用宏基因组技术对这些微生物资源进行研究已成为海洋微生物资源开发的一个新热点。 本研究基于中山大学生物防治国家重点实验室提供的胡安德富卡洋脊热液区喷口处极端微生物Fosmid宏基因组文库大约3000个克隆的测序资料,通过BLAST程序比对目前已知的序列信息,整理出该宏基因组文库中包含的127个耐热酶基因片段。进行工业应用前景分析之后,选取了具有工业应用潜力的糖苷水解酶57家族(GH-57)(宏基因组文库编号CL2343 Contigl)基因进行活性和功能研究。 首先在Fosmid宏基因组文库中筛选劝-57基因片段后两边测序获得基因全长;其次,对gh-57基因的序列分析、保守性比对和蛋白质结构模拟;接着,将gh-57基因在原核表达系统pQE30中进行表达与纯化;最后,对GH-57蛋白进行酶活性测定。 gh-57基因长1632 bp,编码544氨基酸(AA)长度的片段,蛋白预期大小为62.2kDa,等电点5.84。该序列已提交GenBank,获得序列号HQ324240。同源性比较结果发现,gh-57基因与来源于Geobacter sp. M21 (GenBank accession number CP001661)及Geobacter bemidjiensis Bem (CP001124)的劝-57基因有最高68%的核苷酸序列同源性。预期编码的蛋白与Moorella thermoacetica (ABC20110)的GH-57蛋白有最高62%的氨基酸序列同源性,其次是与Desulfovibrio fructosovorans JJ (EFL49755)的GH-57蛋白有60%的氨基酸序列同源性。对该基因预期编码的催化功能区域进行分析发现,在该GH-57蛋白N端有一长为304个氨基酸的糖苷水解酶57区域(Pfam030065),而C端有一个与糖苷水解酶功能相关的分布于细菌中的DUF3536区域。对基因的保守序列进行分析发现,该劝-57基因具有该家族最保守的5个区域、2个催化残基和6个高度保守的氨基酸残基,是一个非常典型的GH-57家族成员。蛋白质三维结构模拟结果显示,该GH-57蛋白与已经报道的具有α-淀粉酶活性的GH-57家族成员PH0193具有非常相似的蛋白质三维结构。 表达与纯化后获得的重组GH-57蛋白的α-淀粉酶活性测定结果显示该酶作用的最适pH值为7.5,最适温度为90℃,在100℃时相对酶活仍能达到60.0%。对该酶进行热失活反应发现,该酶在90℃处理4 h,其相对酶活仍能保留73.0%。该酶具有一定的DTT依赖性,在DTT浓度为30 mM时其相对酶活是无DTT时的5.37倍。MgCl2对该酶有一定的促进作用,但不显著:ATP、CaCl2均对该酶有较明显的抑制作用;EDTA会完全抑制该酶活性。这一结果与已经报道的来源于超嗜热菌Thermotoga maritima MSB8的一个GH-57蛋白的特点类似,但与已报道的常温α-淀粉酶和有α-淀粉酶功能的其他GH-57家族蛋白存在明显不同。


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1 记者 魏公铭;南京农大等攻关成功猪链球菌病防控技术[N];中国食品报;2008年
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