AL-1单用及联合用药对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其作用机理研究

【摘要】：目的 穿心莲内酯(Andro)是中药穿心莲的主要有效成分之一,具有抗菌、抗肿瘤、降糖以及其它药理活性。AL-1是我们设计合成的全新穿心莲内酯衍生物之一,前期抗菌活性研究发现它可以抑制铜绿假单胞菌(PA)生物膜的形成和减少其毒力因子的产生。本研究在前期实验基础上,将单独应用以及同临床上用于治疗铜绿假单胞菌感染有良好疗效的链霉素、阿奇霉素、红霉素、环丙沙星、庆大霉素和磷霉素联合应用,深入探讨AL-1单独及联合用药对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其可能的作用机理,希望获得具有独特作用机理的全新抗菌药物,并为指导临床治疗铜绿假单胞菌感染联合用药提供理论依据。 方法 1.应用标准微量二倍稀释法测定AL-1、Andro、穿琥宁、链霉素、阿奇霉素、红霉素、环丙沙星、庆大霉素和磷霉素最低抑菌浓度,分别观察其对铜绿假单胞菌生长的影响； 2.通过扫描电子显微镜定性观察AL-1单独及联合用药对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响； 3.应用结晶紫染色法定量测定AL-1单独和联合用药对铜绿假单胞菌生物膜形成过程的影响； 4.通过激光共聚焦显微镜定性研究AL-1单独及联合用药对铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖分布和存在状态的影响； 5.应用硫酸-苯酚法定量测定AL-1单独及联合用药对铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖的作用,探讨AL-1抑制生物膜形成的作用机理； 6.应用紫外分光光度计定量测定AL-1单独及联合用药后铜绿假单胞菌产生绿脓菌素和蛋白水解酶活性的情况,探讨AL-1单独及联合用药对铜绿假单胞菌QS系统的作用。 结果 1.天然Andro和其衍生物穿琥宁(CA)对铜绿假单胞菌均无直接抗菌活性,但我们合成的新化合物AL-1在一定程度上却能抑制铜绿假单胞菌的生长。 2.通过扫描电子显微镜观察到AL-1可以抑制铜绿假单胞菌表面纤维连接结构的形成和黏液的分泌,阻止成熟生物膜的形成；与阿奇霉素等抗生素联合用药后,载体表面菌体黏附明显减少,没有粘液样物质产生,细菌多呈散在分布。 3.AL-1单独应用可以显著抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,其抑制作用较相同浓度的Andro更强；AL-1联合阿奇霉素等抗生素后,其抑制铜绿假单胞菌生物膜形成作用显著增强。 4.染色后共聚焦显微镜观察显示,AL-1可以减少铜绿假单胞菌产生胞外多糖,菌落分布稀疏,其作用显著强于等浓度的Andro;AL-1联合阿奇霉素等抗生素后对细菌胞外多糖的形成、分布产生的影响较它们单独使用时更加明显。 5.AL-1以及阿奇霉素、环丙沙星等抗生素单独作用后,铜绿假单胞菌单位细菌所分泌的胞外多糖均明显减少；当AL-1与抗生素联合用药后,其对胞外多糖蛋白复合物形成的抑制作用显著强于单独使用AL-1及其它抗生素的作用。 6.AL-1可以显著降低铜绿假单胞菌毒力因子绿脓菌素的产生和蛋白水解酶的活性；AL-1联合阿奇霉素、庆大霉素、链霉素和红霉素对绿脓菌素的抑制作用显著增加；AL-1联合阿奇霉素、环丙沙星和红霉素还能明显降低蛋白水解酶的活性。 结论 穿心莲内酯衍生物AL-1对铜绿假单胞菌的生长有一定的影响,而其亚抑菌浓度时对铜绿假单胞菌生物膜的形成有强烈的抑制作用,与阿奇霉素、庆大霉素、环丙沙星、磷霉素、链霉素、红霉素等抗生素联合用药后,对抑制铜绿假单胞菌生物膜形成有协同作用。 AL-1能抑制铜绿假单胞菌产生胞外多糖,阻碍其聚集形成微菌落,干扰其群体感应密度系统,抑制毒力因子绿脓菌素产生和蛋白水解酶的活性,而且其作用强于母体化合物穿心莲内酯,与阿奇霉素、庆大霉素、环丙沙星等抗生素联合用药,还能协同产生抑制作用。说明我们合成的AL-1可能是通过以上几种途径发挥其生物膜抑制作用的,并且有望成为临床上治疗铜绿假单胞菌引起的严重感染性疾病的药物。