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雄激素对小鼠附睾组织基因表达谱调控的研究

卢苇  
【摘要】:附睾作为男性生殖系统的重要器官,是精子成熟的场所。精子运动能力的形成、顶体功能的完善、代谢类型的转变、精卵的识别和融合等一系列功能均是精子在通过附睾的过程中,与附睾微环境相互作用而逐渐获得的。 目前已知,附睾的结构完整和功能实现很大程度上依赖于附睾液中雄激素的水平。实验证明,应用雄激素拮抗剂后,动物的精子质量和生育力明显下降,但是其具体的分子机制尚不清楚。 表达谱基因芯片是目前应用广泛的基因芯片之一,可大规模地筛选并对表达差异的基因进行组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性等方面的综合分析,并且芯片结果通过聚类分析和基因注释功能可以更全面地反映特定生理过程的机理、作用靶点和具体途径。本课题即应用小鼠全基因组表达谱芯片对雄激素在附睾功能和精子成熟过程中的作用及其分子机制进行研究。 目的 研究雄激素拮抗剂度他雄胺(Dutasteride)对小鼠附睾精子成熟的影响。通过分析附睾基因表达谱,初步筛选和验证附睾中受雄激素调控且与精子成熟的相关基因,为研究精子成熟的分子生物学机理以及男性不育症的治疗提供参考资料。 材料与方法 将36只SPF级雄性C57/BL小鼠(6-8周)分为3组,每组12只,分别为对照组、低剂量组和高剂量组。给药方式为灌胃给药,其中高剂量组给予度他雄胺7.5 mg/kg/d,低剂量组给予度他雄胺1.5 mg/kg/d,对照组给予等体积玉米油,连续给药8周。给药结束后,对各组小鼠睾丸和附睾器官进行称重,评价给药后小鼠生殖器官的重量变化;应用计算机辅助精子分析系统(Computer assisted sperm analysis system, CASA)分析各组小鼠附睾精子的密度、前向运动率和活动率,评价给药后小鼠附睾的精子质量;应用酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测各组小鼠血清中睾酮和双氢睾酮浓度,评价给药后小鼠体内的雄激素水平。 应用NimbleGen小鼠全基因组表达谱芯片对高剂量组和对照组小鼠的附睾基因表达差异进行研究。应用Trizol法对附睾组织进行RNA抽提并用紫外定量与电泳质检,接着进行cDNA合成、纯化和样品标记,进而在NimbleGen hybridization system 4上进行芯片杂交。16小时后,将芯片放入GenePix 4000B中进行扫描,使用GenePix pro V6.0软件对扫描图像进行处理分析,各芯片探针信号经整体均一化后进行比较,根据信号表达强弱筛选出差异基因。使用Genespring和David分析软件对差异基因进行功能分类。 使用实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)对差异基因在细胞水平和组织水平进行验证。以附睾上皮细胞系PC1和附睾组织cDNA为模板,用qPCR法验证PSMB8、GSTA1、AQP1和IGFBP4四个基因mRNA水平的变化。最后,本文结合文献对已验证的差异表达基因的生物学功能进行了综合分析。 结果 度他雄胺低剂量组和高剂量组小鼠血清中DHT浓度较对照组均显著降低(P0.01),T浓度较对照组无显著差异(P0.05)。度他雄胺低剂量组和高剂量组的附睾平均重量降低(低剂量组P0.05,高剂量组P0.01),睾丸的平均重量无显著差异(P0.05)。CASA分析结果显示,度他雄胺组小鼠精子的密度、前向运动率和活动率均降低。 使用基因芯片对度他雄胺高剂量组和对照组小鼠附睾组织的基因表达谱进行研究。结果显示,与对照组相比,度他雄胺组有1227个基因表达发生显著变化,其中降低的有635个,升高的有592个。差异基因主要涉及大分子的代谢和转运、细胞信息交流、细胞凋亡、雄激素代谢和转移酶活性等生理过程。 本课题对度他雄胺诱导的小鼠的附睾组织基因表达谱进行了研究,并且用qPCR法对其中一些基因进行了验证,结果与芯片结果一致。 结论 将附睾精子质量与DHT水平之间进行比较,结果表明,度他雄胺浓度升高时,血清中的DHT水平降低,随之附睾尾部精子质量也降低。 应用基因芯片对小鼠附睾基因表达谱进行了研究,初步建立了附睾中精子成熟相关基因的表达谱数据库,为研究精子成熟的分子生物学机理提供参考资料。


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