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DJ-1对人脑胶质瘤去分化与迁移侵袭的调控

方茅  
【摘要】:1.研究背景: 人脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤,约占全部颅内肿瘤的40%-50%。胶质瘤分化和侵袭程度直接与WHO的分级密切相关。因此,研究胶质瘤细胞分化及其迁移侵袭的分子机制,不仅有助于阐明胶质瘤的发生机制,还有助于寻找和鉴定具有诊断和治疗价值的胶质瘤细胞分子标志物。 目前研究发现,DJ-1/PARK 7(Parkinson disease(autosomal recessive,early onset)7, DJ-1/PARK 7)在多种肿瘤组织中呈高表达,与肿瘤的发生密切相关,但其在人脑胶质瘤的研究不多。DJ-1在胶质瘤细胞分化和迁移侵袭的过程中扮演着怎样的角色?有必要进一步通过体内外的研究方法相互结合解构肿瘤发生的本质,分析DJ-1与10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN).β-连接素(catenin,beta interacting protein 1,β-catenin)等相关蛋白与胶质瘤的分化,迁移及侵袭的相关性,为阐明胶质瘤发病的分子调控机制提供新的内涵。 2.研究目的: 本研究旨在探讨DJ-1基因在胶质瘤去分化及迁移侵袭中的作用,并研究其作用机制。为寻找和鉴定具有诊断和治疗价值的胶质瘤细胞分子标志物,为分化诱导治疗以及正在进行临床研究的基因治疗提供新的靶点。 3.研究方法: 1)体外培养三株不同分化水平的胶质瘤细胞SWO-38.SWO-Z1.SW0-Z2,通过共聚焦显微镜观察DJ-1在胶质瘤细胞中的表达情况。采用Western blot分析,胶质瘤细胞经过小分子RNA干扰前后,DJ-1与PTEN.p-catenin蛋白表达量的改变。通过体外实验,探讨DJ-1调控胶质瘤去分化的作用机制。 2)通过免疫组化方法分析85例不同级别的人脑胶质瘤组织中DJ-1的表达情况,分析DJ-1与胶质瘤WHO分级之间的关系。 3)根据人DJ-1 mRNA编码序列,设计并构建了DJ-1表达载体。采用pEGFP/DJ-1及其si DJ-1转染SWO-38细胞后,通过Transwell实验分析DJ-1在SWO-38细胞迁移侵袭的作用。用pEGFP/DJ-1及si DJ-1转染SWO-38细胞24 h后,通过Western blot检测DJ-1与PTEN、FAK磷酸化水平的改变。 4)MTT法检测表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-Gallate, EGCG)作用SWO-38细胞24 h的增殖抑制率,确定后续实验的最佳作用浓度。用Transwell实验分析EGCG对SWO-38细胞迁移侵袭的抑制作用。用pEGFP/DJ-1阻断EGCG作用SWO-38的信号通路,Western blot及Transwell实验观察EGCG是否通过下调DJ-1抑制胶质瘤细胞迁移侵袭。 4.研究结果: 1)DJ-1在三株不同分化水平的胶质瘤细胞系SWO-38、SWO-Z1 SWO-Z2中的表达 DJ-1在SWO-38中表达量最高,在分化程度最低的SWO-Z1中表达量最低。β-catenin蛋白表达量在三株细胞中的变化趋势与DJ-1基本一致。PTEN表达量在三株细胞中变化不明显。 2) si DJ-1转染SWO-38细胞24h, DJ-1、PTEN与β-catenin蛋白表达量改变 si DJ-1有效下调SWO-38细胞中DJ-1表达,并影响β-catenin.蛋白的表达,使其出现明显下降。si DJ-1转染SWO-38细胞24 h,转染组G2期的细胞数与对照组相比较,差异有统计学意义(P0.05),出现细胞周期阻滞。 3) DJ-1在85例不同级别的胶质瘤组织中的表达 经统计学分析,胶质瘤各分级之间DJ-1的表达量有显著差异(P0.01),且随着胶质瘤恶性程度的增加,DJ-1在细胞浆内的表达量也随着增加。 4)过表达及下调SWO-38细胞的DJ-1表达,影响胶质瘤细胞的迁移侵袭 设计并构建了人DJ-1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP/DJ-1。经过转染,SW038细胞DJ-1的表达水平升高,PTEN的表达水平下降,局灶粘着激酶(focal adhesion kinas)的磷酸化(p-FAK)水平升高;SWO-38细胞转染si DJ-1后,DJ-1表达水平下降,PTEN表达水平升高,p-FAK的水平降低。体外迁移与侵袭实验发现,转染pEGFP/DJ-1促进SWO-38细胞的迁移和侵袭,与对照组相比较,差异有统计学意义(P0.05)。转染si DJ-1抑制SWO-38细胞的迁移和侵袭,与对照组相比较,差异有统计学意义(P0.05)。 5) EGCG下调DJ-1的表达抑制SWO-38细胞的迁移和侵袭 EGCG单独处理SWO-38细胞,下调DJ-1的蛋白表达量并抑制了细胞的迁移侵袭;单独使用pEGFP/DJ-1处理SWO-38细胞,与对照组SWO-38细胞相比较,DJ-1的表达水平升高,促进了细胞的迁移和侵袭,有统计学差异(P0.05)。通过pEGFP/DJ-1阻断EGCG抑制SWO-38细胞迁移侵袭的可能通路,联合pEGFP/DJ-1和EGCG处理胶质瘤SWO-38细胞24 h后,与EGCG组相比,细胞迁移和侵袭能力不能完全被EGCG抑制。同时,DJ-1的表达和FAK的磷酸化也不能被EGCG下调。 5.结论: 1)DJ-1抑制PTEN促进β-catenin蛋白表达,而下调DJ-1能够阻滞细胞周期。因此,DJ-1参与调节胶质瘤细胞的去分化。 2)DJ-1的表达与胶质瘤的分级呈正相关,即随着胶质瘤恶性程度的增加,其DJ-1在细胞浆内的表达量也随之增加。 3)DJ-1能促进人脑胶质瘤SWO-38细胞的迁移与侵袭。这可能与DJ-1抑制PTEN表达,提高FAK的去磷酸化水平从而促进肿瘤细胞的迁移侵袭有关。 4) EGCG抑制SWO-38迁移的机制可能与抑制DJ-1的表达而促进PTEN表达相关。


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