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氧化固醇结合蛋白家族相互作用蛋白组的鉴定和功能研究

李实骞  
【摘要】:一类含有与氧化固醇结合蛋白(OSBP)相关的配体结合域的蛋白家族已经在真核生物中被鉴定出来,这些蛋白,被命名为OSBP相关蛋白(OSBP-related proteins (ORPs))或者OSBP样蛋白(OSBP-like proteins(OSBPL))。对酿酒酵母中的ORPs研究结果表明这些蛋白在固醇的细胞内非囊泡运输、高尔基体上的分泌型小泡运输以及细胞极性的建立中起作用。对哺乳动物的ORPs功能研究显示ORPs在有很多方面都起作用:固醇和鞘磷脂代谢的整合,固醇运输,中性脂代谢的调节,微管依赖性内涵体/溶酶体运动的调控以及信号级联的调节。然而,对ORPs参与上述功能的机制的理解,尚未明了。在本研究中,我们构建了十二个人类ORPs基因的诱饵载体,利用这此诱饵载体筛选了人胚肾cDNA文库和来源于多种成人组织的Univerval文库,筛选出的与ORPs相互作用的蛋白质,功能大致涉及到以下方面:细胞信号传导、囊泡运输、脂代谢、细胞骨架调节蛋白,糖代谢,离子转运,及血液凝集等。我们选择了相关蛋白进行了详尽地功能研究。 通过GST-Pull down, Co-IP实验确证了ORP8与核孔复合体蛋白NUP62物理结合后。我们发现,在人类肝癌细胞系Huh7, NUP62参与了过表达ORP8对甾醇调控元件结合蛋白(SREBPs)核内含量的下调;腺病毒介导小鼠肝脏的ORP8过表达降低导致血浆和肝组织中胆固醇,磷脂和甘油三酯的下降(在血浆中分别为-34%,-26%,-37%,在肝组织中分别为-40%,-12%,-24%),这种下降与核内nSREBPs的下降一致。在Huh-7细胞中,过表达ORP8导致核内SREBPs的降低,SREBP-2靶基因mRNA的表达下降和胆固醇合成减少,而沉默ORP8增加SREBP-2靶基因mRNA的表达。这些实验揭示了ORP8是一个生物体脂质平衡新的调节者。 我们证明了ORP11与ORP9形成二聚体。ORP11缺乏FFAT模体或其它ER定位信号,通过产生的亲和纯化抗体,我们发现该这新蛋白的组织和细胞型特异表达模式,并证明了它在细胞中分布于高尔基体和晚期内体膜之间。我们分析了ORP11膜定位的决定因素,表明ORP9是ORP11定位到高尔基体的一个决定因素。过表达ORP9招募过表达的EGFP-ORP11到内质网和高尔基体上,沉默ORP9抑制了内源性ORP11在高尔基体上的定位。ORP9与ORP11可能形成二聚体作为一个脂质的感受器和转运子。 我们还进一步研究了内质网膜上三磷脂肌醇(IP3)受体ITPR1与ORP4之间的相互作用,通过Co-IP,双分子荧光互补(Bimolecular FluorescenceComplementation, BiFC)实验确证了这对相互作用。ITPR1是细胞内内质网上的钙离子通道,在人宫颈癌上皮细胞系HeLa, ORP4沉默后细胞质中[Ca2+]在Histamine的刺激下峰值下降,表明细胞质钙含量降低。初步实验显示ORP4干扰增加细胞在毒胡萝卜素诱导后的凋亡率。


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