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壳寡糖细胞内的亚定位及其在NF-κB通路、抗肿瘤、成骨分化中的作用

李贤  
【摘要】:研究目的:壳寡糖(Chitooligosaccharide, COS))是壳聚糖的降解产物,是一类由2-10个氨基葡糖通过β-1,4糖苷键连接起来的低聚合度水溶性的糖类。与壳聚糖相比,COS相对分子质量小、水溶性好,易被组织吸收,壳寡糖可与多种细胞相互作用,并具有多种生物功能,这些功能的发挥必然与其进入细胞的过程,及影响细胞内部的相关信号通路有关。本文在探讨了壳寡糖对NF-κB信号通路影响的基础上,还对壳寡糖的抗肿瘤和促脐血干细胞分化作用进行了初步研究,并借助FITC标记,探索壳寡糖在细胞内的亚定位,进一步探明壳寡糖与细胞间的相互作用机制。 实验方法: (1)测定壳寡糖作用后细胞内NF-κB依赖荧光素酶活性的变化;应用激光共聚焦显微镜观察壳寡糖对NF-κB核迁移的影响;实时定量荧光PCR技术检测壳寡糖对NF-κB信号系统下游相关基因mRNA的表达的影响; (2)观察COS刺激后细胞形状变化及超微结构改变,活死细胞染色确定壳寡糖对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪及定量PCR检测COS对肿瘤细胞线粒体膜电位及抗凋亡蛋白mRNA表达情况:利用蛋白组学技术筛选出差异表达蛋白,并通过western blot在蛋白水平进行验证,进一步探索壳寡糖抗肿瘤的机理; (3)荧光定量PCR技术研究壳寡糖对细胞周期蛋白cyclinDl和骨特异转录因子RUNX2、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2, BMP2) mRNA表达的调控。茜素红染色观察钙结节的形成情况; (4)对COS进行FITC标记,细胞转染一定位于线粒体质粒pDsRed-Mit,流式细胞仪观测壳寡糖进入细胞内的浓度,利用激光共聚焦显微镜观察COS进入细胞内情况及其在细胞中的亚定位,进一步了解COS与细胞相互作用的亚细胞学机制。 研究结果:(1)壳寡糖可提高NF-κB信号通路的活性,且0.1mg/ml的壳寡糖作用最为明显。(2)壳寡糖可影响NF-κB依赖的荧光素酶活性、NF-κB下游基因的表达、及NF-κB亚基的核转位,其中COS4与COS6具有较突出的作用。(3)COS作用肿瘤细胞后,细胞形态出现变化,有些细胞呈梭形,有些呈圆形,有些细胞已经飘起;有凋亡小体产生,细胞胞核内的染色质不均匀,呈块状,可见染色质边集。4天后,死亡的肿瘤细胞比率明显增多,占38.6%,对照组仅为3.4%,细胞线粒体膜电位降低。研究发现壳寡糖可影响肿瘤细胞内cyclin D1、bcl-2和bcl-xl基因表达,其中COS6的作用最强。蛋白组学及western blot显示,壳寡糖可降低肿瘤细胞内LASP-1的表达。(4)壳寡糖还可促进脐血间充质干细胞增殖,且浓度为100-300μg/ml的壳寡糖作用最为显著。研究发现壳寡糖可在晚期刺激脐血间充质干细胞ALP的表达、茜素红染色部分细胞呈现出阳性结果。(5)研究还发现COS进入细胞的速度非常快,10min时即可在细胞内见到COS的存在,并可在一定时间内达到饱和,去掉外界的COS时,细胞内的COS定位未发生明显变化。(6)低浓度时COS主要分布于细胞核周围,并且呈现出点状或棒状,定位与DsRed-Mit吻合;随着浓度的加大,COS不仅仅主要局限于线粒体,胞浆、胞核均有COS存在,且可在核膜和核仁富集。 结论: 壳寡糖在NF-κB信号通路、肿瘤凋亡信号通路、成骨细胞分化信号通路方面均发挥着重要的作用,可增加NF-κB信号通路活性,抑制肿瘤的增殖,促进脐血间充质干细胞向成骨细胞分化。本文首次筛选出与壳寡糖抗肿瘤作用相关的蛋白LASP1,并基本探明COS进入细胞的过程以及在细胞内的亚定位情况。研究首次发现壳寡糖在细胞内优先定位于线粒体,且随浓度的变化,定位也发生改变,说明壳寡糖的浓度明显影响COS在细胞内的定位。研究还发现壳寡糖的细胞活性与壳寡糖的分子量无明显的线性关系。因此壳寡糖分子结构及其与相关蛋白结合时形成的复合体的三维结构可能是另一重要因素,为研究壳寡糖与细胞间的相互作用提供一新的理论基础。


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