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神经生长因子及p75~(NTR)蛋白对肝细胞生物学作用的初步研究

李俊峰  
【摘要】:肝脏是人体生物转化和解毒的重要器管。病毒、内毒素、代谢与免疫等因素可引起肝细胞损伤、坏死/凋亡。肝细胞坏死/凋亡是急、慢性肝脏疾病包括爆发性肝炎、肝纤维化等肝病的基本病理过程。肝纤维化是由于损伤的肝细胞释放的凋亡小体(apoptotic bodies),被库普弗细胞(kupffer cell)和肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)吞噬,释放炎症趋化因子和细胞因子,激活HSC和门脉成纤维细胞(portalfibroblast)转分化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MyoFB),导致细胞外基质(extra-cellular matrix, ECM)过度沉积的病理过程。因此,保护肝细胞,减少肝细胞凋亡是治疗肝纤维化的重要策略。 神经生长因子(nerve growth factor, NGF)由神经细胞和非神经细胞合成,调控细胞的分化、增殖及凋亡,是多效性的生长因子。NGF通过旁分泌或自分泌方式,调节神经营养素受体TrkANGFR(tropomyosin trkA tyrosine kinase receptor)和p75~(NTR)(p75pan-neurotrophin receptor)的表达,调控成纤维细胞、炎症及免疫等细胞活性/凋亡,参与组织创伤-修复和组织重塑的病理生理过程。肝损伤时,增殖的肝细胞和活化的HSC合成NGF通过p75~(NTR)信号传导途径诱导HSC分化/凋亡,调控肝损伤-修复病程。目前,NGF与p75~(NTR)蛋白对肝细胞生物学作用的相关研究较少,本研究旨在探讨外源性重组人NGF和p75~(NTR)蛋白对肝细胞生物学作用。 本实验主要包括以下四部分 第一部分:神经生长因子-β对D-半乳糖胺诱导L-02细胞损伤的保护作用 目的:观察外源性神经生长因子-β(NGF-β)对D-半乳糖胺(D-galactosamine, D-GalN)诱导L-02细胞损伤的保护作用。 方法:体外培养L-02细胞,用不同浓度的NGF-β预处理L-02细胞30min后,加入40mmol/L D-GalN诱导细胞损伤,水飞蓟宾(100mg/L)为阳性对照组,未予处理组为阴性对照,孵育24h,倒置显微镜下观察细胞形态学的变化,XTT法观察各组细胞活性,流式细胞仪(JC-1)法测细胞线粒体膜电位,比色法检测细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、白蛋白(Albumin,ALB)和细胞裂解液中谷胱甘肽(glutathione, GSH)的含量。 结果:D-GalN孵育的L-02细胞膜不连续,呈球形,细胞核与细胞质的亮度对比明显降低;LDH、MDA浓度明显增加,ALB、GSH浓度明显降低;细胞活性、细胞线粒体膜电位明显下降。外源性NGF-β预处理组L-02细胞膜连续,细胞核与细胞质的亮度对比接近未受损伤细胞;NGF-β促进D-GalN损伤的L-02细胞增殖,LDH、MDA浓度明显降低,ALB、GSH浓度明显增加,细胞线粒体膜电位好转。 结论:外源性NGF-β对D-GalN诱导损伤的L-02细胞有明显的保护作用,可能与NGF-β促进L-02细胞合成GSH抑制脂质过氧化反应和恢复线粒体膜电位有关。 第二部分:NGF及TrkANGFR、p75~(NTR)在人肝硬化组织及L-02细胞表达 目的:观察人肝硬化组织和体外培养的L-02细胞NGF及受体TrkANGFR和p75~(NTR)的表达。 方法:免疫组织/细胞化学染色法观察人肝硬化组织石蜡切片和体外培养的L-02细胞NGF、TrkANGFR和p75~(NTR)蛋白表达,Real-time PCR法观察L-02细胞NGF、TrkANGFR和p75~(NTR)mRNA表达情况。 结果:肝硬化组织石蜡切片和L-02细胞NGF、p75~(NTR)、TrkANGFR免疫组织/细胞化学染色呈阳性,NGF主要位于肝细胞的细胞质和细胞核,TrkANGFR、p75~(NTR)主要位于细胞膜和细胞质。Real-time PCR法L-02细胞表达NGF、TrkANGFR和p75~(NTR)mRNA。 结论:人肝硬化组织和L-02细胞检测到NGF、TrkANGFR和p75~(NTR)的表达。 第三部分:神经生长因子-β通过TrkANGFR信号途径促进L-02细胞增殖 目的:观察外源性神经生长因子-(βNGF-β)对L-02细胞NGF及受体TrkANGFR和p75~(NTR)表达的影响,NGF-β对L-02细胞的生物学作用。 方法:体外培养L-02细胞,免疫细胞化学和荧光定量PCR法,分别检测NGF、TrkANGFR、p75~(NTR)在L-02细胞中的表达。XTT法检测外源性NGF-β、anti-NGF、anti-TrkANGFR、anti-p75~(NTR)对L-02细胞增殖作用的影响,流式细胞术(Annexin V/PI)及(PI)检测外源性NGF-β对L-02细胞凋亡及细胞周期的影响。 结果:外源性NGF-β促进L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75~(NTR);外源性NGF-β(12.5-200μg/L)促进L-02细胞有丝分裂,由G1期进入S期,促进细胞增殖、有抗细胞凋亡趋势,高剂量(400μg/L)NGF-β不能促进L-02细胞增殖;anti-NGF、anti-TrkANGFR抑制NGF-β诱导的L-02细胞增殖,anti-p75~(NTR)并不影响NGF-β诱导的L-02细胞增殖。 结论:外源性NGF-β促进L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75~(NTR);外源性NGF-β可能通过TrkANGFR信号途径促进L-02细胞增殖。 第四部分:p75~(NTR)蛋白体外通过TrkANGFR/p75~(NTR)异源二聚体信号途径促进L-02细胞增殖 目的:观察外源性p75~(NTR)蛋白对L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75~(NTR)的影响,及外源性p75~(NTR)蛋白对L-02细胞的生物学作用。 方法:体外培养L-02细胞,免疫细胞化学和荧光定量PCR法,分别检测NGF、TrkANGFR、p75~(NTR)在L-02细胞中的表达。XTT法检测外源性p75~(NTR)、NGF-β、NGF-β+p75~(NTR)、anti-TrkANGFR、anti-p75~(NTR)对L-02细胞增殖作用,流式细胞术(AnnexinV/PI)及(PI)检测外源性p75~(NTR)对L-02细胞凋亡及细胞周期的影响。 结果:外源性p75~(NTR)蛋白促进L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75~(NTR);外源性p75~(NTR)蛋白促进L-02细胞有丝分裂,由G1期进入S期,促进细胞增殖、有抗细胞凋亡趋势;外源性p75~(NTR)与NGF-β协同促进L-02细胞增殖;anti-TrkANGFR抑制L-02细胞增殖,anti-p75~(NTR)并不影响L-02细胞增殖。 结论:外源性p75~(NTR)蛋白上调L-02细胞NGF及受体TrkANGFR、p75~(NTR)的表达,外源性p75~(NTR)蛋白可能通过TrkANGFR/p75~(NTR)异源二聚体信号途径促进L-02细胞增殖。


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