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结直肠癌细胞驯化巨噬细胞的蛋白组学研究

乐尧金  
【摘要】:肿瘤细胞往往通过与其微环境组分(包括巨噬细胞、成纤维细胞和胞外基质等)交互作用,共同形成促进肿瘤的增生、侵袭和转移的肿瘤微环境。具有极强的可塑性的肿瘤相关巨噬细胞参与肿瘤上述进程中。目的:运用定量蛋白组学,探索癌症细胞驯化的巨噬细胞的蛋白组成改变,发现其细胞表型变化及涉及的信号通路,为干预肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进过程中的生物学行为提供理论和实验依据。 方法: 1.以Caco-2细胞培养上清介导的THP-1巨噬细胞为癌细胞驯化的巨噬细胞(cancer-cell educated macrophage, CEM)模型,运用双向电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)分析并鉴定有无癌细胞培养上清驯化的条件下的差异表达蛋白,进而利用Ingenuity pathwaysanalysis (IPA)软件进行生物信息学分析这些差异蛋白所调节的信号通路,并且利用免疫印迹方法、荧光共聚焦显微镜进行生物学功能验证。 2.以CT26细胞培养上清介导小鼠骨髓来源巨噬细胞诱导CEM模型,应用稳定同位素标记细胞培养(SILAC)定量蛋白组学技术,分别用重链标记CEM细胞,轻链标记巨噬细胞(Mφ细胞),提取细胞总蛋白酶解成肽段,LTQ OrbitrapMS/MS质谱鉴定差异蛋白。使用IPA软件进行生物信息学分析差异蛋白对应的功能网络,WST-1检测进行表型验证。 结果: 1.在THP-1巨噬细胞来源CEM模型中,建立了有无癌细胞培养上清驯化的巨噬细胞双向凝胶电泳图谱,鉴定了差异表达2倍以上的蛋白60个。其中13个表达上调,47个表达下调。IPA分析显示这些差异蛋白可能参与细胞凋亡/存活信号通路,提示CEM具有抗凋亡表型。Western blot检测CEM中Bcl-2高表达,共聚焦荧光显微镜观察显示CEM中Cleaved Caspase37的表达明显弱于巨噬细胞。 2.在小鼠骨髓来源巨噬细胞诱导CEM模型中,SILAC技术和定量结果,2个以上Unique Peptides的蛋白有1296个,蛋白表达差异倍数1.5倍以上的蛋白数量有100个,在CEM中表达上调58个,下调42个。IPA分析显示在差异蛋白影响脂代谢,分子转运,蛋白转运等网络通路。WST-1检测显示与对照相比CEM的增殖能力显著增强。 结论: 1.成功建立体外研究肿瘤相关巨噬细胞模型,并且采用这些模型对CEM的蛋白组成进行定量分析。 2.癌症细胞介导的CEM具有抗凋亡和促增殖表型。


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