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重组鲨鱼血管抑制因子活性片段蛋白aSAIF纯化工艺及其抑制肿瘤机制研究

彭雯丹  
【摘要】:目的:在构建了重组工程菌BL21(DE3)/PET-3C/aSAIF-SUMO的基础上,对重组鲨鱼血管抑制因子(aSAIF)的高密度发酵条件及中试纯化工艺进行优化,初步探讨其抑制肿瘤生长及血管生成的机制。 方法:在5L发酵罐中进行工程菌培养,优化IPTG诱导浓度及时间点。利用离子交换层析和镍柱亲和层析对带有组氨酸标签的重组鲨鱼血管抑制因子融合蛋白His-SUMO-aSAIF进行纯化,并在纯化过程中尝试以HPLC监测aSAIF-SUMO融合蛋白纯化流程。纯化后的融合蛋白进行小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)酶切,切除了SUMO蛋白后的非融合aSAIF经镍柱二次亲和层析获得,并进行血管抑制活性检测、流式检测细胞凋亡及周期情况、基因表达谱芯片分析等。 结果:确立工程菌发酵罐培养的IPTG诱导时间点为接种3小时后,诱导浓度为1mmol/L。优化后的纯化工艺参数为:离子交换层析采用0.2mol/L NaCl进行洗脱;亲和层析则采用250mmol/L咪唑进行洗脱;SUMO蛋白酶与融合蛋白的最佳酶切比例为1:480,酶切时间为1h。最终获得的aSAIF蛋白纯度可达95%,并证实其具有抑制血管生成的生物学活性,但可能并非通过促进细胞凋亡或周期变化发挥作用,通过表达谱芯片初步筛选出一部分差异基因,发现其主要聚集于细胞运动、细胞发育、细胞生长与增殖、细胞凋亡等生物学过程,并集中在细胞装配与组织、骨骼肌肉系统发育及功能和细胞间信号与作用的调控网络。 结论:已成功建立aSAIF的发酵和纯化工艺,并由基因芯片分析筛选出其调控的潜在基因及生物学进程,为后续大规模生产及机制研究奠定基础。


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