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靶向HER2的人β防御素2的表达纯化及体外活性研究

邱壮伟  
【摘要】:目的: 利用小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-like modifier, SUMO)融合表达系统,在大肠杆菌Origami B(DE3)中表达抗HER2单链抗体scFv4D5(以下简写为4D5)与人β防御素2(human β defensin2,HBD2)的重组融合蛋白HBD2-4D5。测定融合蛋白HBD2-4D5的靶向结合活性及体外抗肿瘤活性,从细胞形态学以及信号通路的角度探讨HBD2-4D5对HER2高表达乳腺癌细胞的作用机理,为防御素等免疫调理多肽的靶向研究提供前期基础。 方法: 将编码SUMO-4D5和SUMO-HBD2-4D5的DNA片段克隆到原核表达载体pET-3c中,并转化表达宿主菌E.coli Origami B(DE3),抗生素筛选重组子。采用组氨酸亲和凝胶层析(Ni-NTA sepharose)、特异性SUMO酶(SUMO protease)酶切以及分子筛(Sephadex G-25)联用的方法纯化上述重组蛋白。基于免疫荧光的激光共聚焦扫描显微镜检测HBD2-4D5与细胞表面HER2蛋白的靶向结合能力,CCK-8法检测HBD2-4D5对乳腺癌细胞的抑制作用,运用流式细胞技术检测HBD2-4D5对乳腺癌细胞状态的影响,Western Blot检测HBD2-4D5对细胞凋亡信号分子Bax、Bcl-2的影响,电子扫描显微镜和透射电镜检测HBD2-4D5对乳腺癌细胞超微结构的影响。 结果: 分别含有表达质粒的菌株Origami B (DE3)/pET3c-SUMO-HBD2-4D5和OrigamiB (DE3)/pET3c-SUMO-4D5在20℃,1mM IPTG条件下诱导24h后,分别获得分子量约为46kDa的SUMO-HBD2-4D5和42kDa的SUMO-4D5,表达量分别占菌体可溶性总蛋白的40.2%和49.3%。通过组氨酸亲和凝胶层析(Ni-NTAsepharose)、特异性SUMO酶(SUMO protease)酶切以及分子筛(Sephadex G-25)联用的方法纯化目的蛋白,可得到纯度大于90%的蛋白HBD2-4D5和蛋白4D5,最终得率分别为25mg/L和40mg/L。基于免疫荧光的激光共聚焦扫描显微镜检测结果显示,HBD2-4D5能与SK-BR-3和SK-OV-3细胞膜表面的HER2结合并部分内吞进入胞浆,但与HER2低表达MDA-MB-231细胞则没有明显结合。融合蛋白HBD2-4D5对HER2过表达的人乳腺癌细胞株SK-BR-3的IC50为3.2±0.17μM,但同等摩尔浓度的融合蛋白HBD2-4D5对HER2低表达的人乳腺癌细胞MDA-MB-231则未表现出明显的抑制作用;对照蛋白HBD2、4D5在同等摩尔浓度下对SK-BR-3、MDA-MB-231均没有明显抑制作用。流式细胞术检测结果显示,当HBD2-4D5作用浓度为3.2μM和6.4μM时,32.6±3.32%和67.15±5.13%的SK-BR-3细胞处于晚期凋亡或为细胞碎片状态。Western blot检测结果表明,SK-BR-3细胞株经3.2μM HBD2-4D5处理4h后,胞内促凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,Bax/Bcl-2表达量比例上调为未处理组的4.0倍,表明HBD2-4D5具有促进HER2高表达SK-BR-3细胞凋亡的作用。电子扫描显微镜和透射电镜观察结果显示,HBD2-4D5能有效地靶向并聚集于HER2高表达SK-BR-3细胞,对膜进行攻击并使膜穿孔,内容物外泄造成大量细胞坏死;并引起部分细胞出现典型的凋亡样超微结构病变。 结论: 基于anti-HER2scFv的融合蛋白HBD2-4D5具有乳腺癌细胞HER/neu靶向的细胞毒作用,在一定剂量下,以引起细胞膜破裂和细胞凋亡的方式发挥其杀细胞作用。


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