玉米赤霉烯酮无毒ELISA检测方法的初步建立及脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟表位的筛选

【摘要】：目的：本研究可分为两个部分，第一部分利用实验室已制备的玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）单抗及ZEN抗独特型单抗建立无毒ELISA免疫学检测方法；第二部分利用噬菌体展示技术，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）单抗为配体，获得DON的噬菌体展示抗原模拟表位。 方法：(1)复苏分泌ZEN单抗的杂交瘤细胞株1G4，制备腹水型抗体并进行纯化，利用ZEN抗独特型单抗与毒素ZEN分子构成抗原内影像的关系，建立无毒ELISA免疫学检测方法。 (2)包被DON单抗，对噬菌体随机环七肽库进行四轮生物固相淘选。挑取噬菌斑并采用间接ELISA及间接竞争ELISA鉴定其特异性，提取能与DON单抗特异性结合的阳性克隆DNA，对其PCR产物测序，选出不同序列的阳性克隆，分别建立噬菌体与DON替代关系的竞争曲线。 结果：(1)建立了ZEN无毒ELISA检测方法，其替代曲线回归方程为y=1.284x~(1.931)（R~2=1），y表示ZEN浓度（ng/mL）， x表示抗独特型抗体浓度（μg/mL）；检出限（IC_(10)）为1ng/mL；检测范围（IC_(20)-IC_(80)）为1.041～25.99ng/ml；批内和批间的变异系数均小于或等于12%。 (2)经间接ELISA和间接竞争ELISA，对随机的30个噬菌斑进行鉴定，结果显示有28株噬菌体克隆能与DON单抗结合，其中22株能被DON标准品阻断。这22株噬菌体克隆DNA的PCR产物测序结果显示，有21株噬菌体克隆的氨基酸序列为PFPNHPY，另有一株为TPWTQHL。从中分别挑选一株阳性噬菌体单克隆，建立噬菌体与DON替代关系的竞争曲线，结果显示，8号阳性株建立的替代关系竞争曲线线性范围为29.2ng/ml～636ng/ml， IC50为169ng/ml；4号阳性株建立的替代关系竞争曲线线性范围为12.4ng/ml～271ng/ml，IC50为58ng/ml。 结论：1.利用ZEN单抗及ZEN抗独特型单抗成功建立了ZEN的无毒ELISA检测方法。2.从噬菌体随机环七肽库中筛选到两种不同的DON抗原模拟表位，分别建立了噬菌体与DON替代关系竞争曲线，初步验证获得的DON模拟表位可以替代DON毒素标准品，用于建立DON的无毒免疫学检测技术。