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原花青素对H_2O_2诱导视网膜神经节细胞凋亡的影响及机制初探

王慧  
【摘要】:目的: 本实验拟观察原花青素对H_2O_2引起视网膜神经节细胞RGC-5凋亡的影响,并初步探究其作用机制。在此基础上拟利用原代组织培养模型验证原花青素对视网膜神经节细胞的保护作用。 方法: 第一部分原花青素对H_2O_2诱导视网膜神经节RGC-5细胞凋亡的影响及机制初探 1、H_2O_2损伤模型的建立 (1)细胞鉴定:采用Thy1.1蛋白特异性荧光染色(免疫组化法)对培养视网膜神经节RGC-5细胞进行鉴定; (2)H_2O_2损伤浓度梯度:将H_2O_2按浓度梯度分为0、200、400、600、800μM处理组,在损伤7h后,应用MTT法检测各组细胞活力,观察H_2O_2对视网膜神经节RGC-5细胞的损伤情况。 2、OPC对H_2O_2损伤后RGC-5细胞的影响 (1)OPC安全剂量:观察不同剂量(0-240μM)原花青素对视网膜神经节RGC-5细胞的活力的影响; (2)OPC对损伤后RGC-5细胞的影响: ①M TT检测OPC对H_2O_2(0-800μM)损伤后RGC-5细胞的影响; ②O PC(5、10、20、40μM)对H_2O_2(400μM)损伤后RGC-5细胞凋亡的影响: a. Hoechst33342染色检测各组视网膜神经节RGC-5细胞凋亡情况; b. Annexin-V/PI双染流式细胞术分组检测各组视网膜神经节RGC-5细胞凋亡情况。 3、OPC抗H_2O_2损伤后RGC-5细胞凋亡的机制初探 (1) Western Blot检测观察OPC(10、20、40μM)对H_2O_2(400μM)引起视网膜神经节RGC-5细胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表达量的影响; (2)Western Blot检测观察OPC(10、20、40μM)对H_2O_2(400μM)引起视网膜神经节RGC-5细胞凋亡蛋白Caspase-3表达量的影响。 第二部分:原花青素对原代培养视网膜神经节细胞H_2O_2损伤模型的影响 1、上丘逆行性荧光金标记法特异性标记原代培养的视网膜神经节细胞; 2、H_2O_2损伤模型:将H_2O_2按浓度梯度分为0、100、200、300μM处理组,在损伤7h后,计数各组间带荧光金视网膜神经节细胞的存货率; 3、原代视网膜组织离体培养,荧光视网膜神经节细胞计数(冰冻切片)观察OPC(10、20μM)对视网膜神经节细胞H_2O_2(100μM)损伤模型的影响。 结果: 第一部分原花青素对H_2O_2诱导视网膜神经节RGC-5细胞凋亡的影响及机制初探 1、培养视网膜神经节RGC-5细胞24h后,显微镜下可见细胞贴壁,呈多边形。荧光显微镜下可观察到细胞中有Thy1.1表达,证实培养细胞为视网膜神经节RGC-5细胞。 2、MTT检测结果表明,随着H_2O_2浓度的增加,细胞活力逐渐下降。在400μMH_2O_2浓度下,7h可引起视网膜神经节RGC-5细胞活力下降约32%。加入不同浓度OPC作用后,细胞活力明显增加,且OPC20μM时细胞活力最高。 3、用Hoechst33324染色和Annexin-V/PI双染流式细胞术检测各组间细胞凋亡数目证实,400μM H_2O_2能明显诱导视网膜神经节RGC-5细胞凋亡;加入20μMOPC能显著抑制H_2O_2诱导的视网膜神经节RGC-5细胞的凋亡(P0.05)。 4、Western Blot结果表明,400μM H_2O_2能够引起视网膜神经节RGC-5细胞Bcl-2表达下调,Bax和Caspase-3表达增加;OPC(20、40μM)能显著抑制H_2O_2引起的蛋白表达变化,即Bcl-2蛋白表达增加,Bax、Caspase-3蛋白表达下调(P0.05)。 第二部分:原花青素对原代培养视网膜神经节细胞H_2O_2损伤模型的影响 1、上丘逆行性荧光标记3d后,冰冻切片可见荧光金成功标记视网膜神经节细胞。 2、荧光金细胞计数表明,随着H_2O_2浓度的增加,细胞存活率逐渐下降。在100μMH_2O_2浓度下,7h可引起视网膜神经节细胞存活率下降约53%。加入不同浓度OPC作用后,细胞存活率明显增加,且OPC20μM时细胞存活率最高。 结论: 原花青素(OPC)对H_2O_2引起的视网膜神经节细胞损伤具有对抗作用,它可以减少视网膜神经节细胞的凋亡,增加视网膜神经节细胞的活力。


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